obiecte

abstract

Tiroidita (HT) Hashimoto, care se caracterizează prin producerea de autoanticorpi împotriva glandei tiroide, este o boală autoimună localizată. S-a constatat că HT are un acord de 55% la gemenii monozigoți. 1 Repplinger și colab. 2 afirmă că există o prevalență ridicată a unei incidențe crescute a HT la femei, care este de șapte ori mai mare decât la bărbați. Diversi factori genetici și de mediu sunt implicați în patogeneza acestei boli. 3 Este bine cunoscut faptul că inflamația cronică care apare în timpul HT determină o creștere semnificativă a nivelului de citokine și alți mediatori inflamatori, ceea ce duce în cele din urmă la distrugerea glandei tiroide. 4 Mai precis, interacțiunile mai multor gene și factori de mediu pot crește sensibilitatea la HT și severitatea bolii. 5

Poli (ADP-riboză) polimerază-1 (PARP-1) este considerată a fi una dintre genele candidate responsabile de patogeneza situațiilor inflamatorii. Se consideră că PARP-1 joacă un rol important în inițierea căii de reparare a ADN-ului, deși nivelurile ridicate de activare a acestuia sunt asociate și cu apoptoza crescută. Recent s-a demonstrat că dezvoltarea și progresia bolilor inflamatorii a fost întreruptă în modelele animale knockout PARP-1 care utilizează inhibitori PARP-1. 6, 7 Rezultatele din mai multe studii au arătat că inactivarea PARP-1 protejează împotriva șocului endotoxic, colitei, pneumoniei și a altor boli precum leziuni traumatice ale creierului, ischemie cerebrală și miocardică, accident vascular cerebral, artrită reumatoidă și inimă asociate cu diabetul zaharat. boli. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 Deși rolul exact al PARP-1 în cascada inflamatorie nu este încă cunoscut, toate studiile disponibile despre PARP-1 sugerează că această genă este un candidat puternic și un factor genetic pentru dezvoltarea HT.

S-a demonstrat că gena PARP-1 (OMIM 173870), localizată pe cromozom (1q41-43), conține polimorfisme alelice care sunt asociate cu susceptibilitatea la diferite boli, dintre care unele sunt inflamatorii. În plus, au fost identificate mai multe site-uri de legare a factorului de transcripție în regiunea promotoră a genelor PARP-1; prin urmare, variantele genetice din această regiune pot afecta expresia PARP-1. 17 Au fost identificate mai multe variante (C410T (rs2793378), Poly (A) n, C1362T și G1672A (rs7527192)) în regiunea promotorului și există mai multe studii care au examinat relația dintre aceste polimorfisme ale promotorului și patogeneza multor boli. site-ul T2444C (rs1136410) (cunoscut și sub numele de Val762Ala), care provoacă o schimbare în T în C, Val în Ala în exonul 17, a fost identificat de Cottet și colab. 18 Potrivit lui Wang și colegilor săi, polimorfismul T2444C reduce activitatea enzimatică a PARP-1 cu

În acest studiu, am întrebat dacă doi polimorfisme promotor (rs2793378 și rs7527192) și un polimorfism cu sit activ (rs1136410) în gena PARP-1 ar putea predispune indivizii la boala HT în populația feminină turcă.

Pacienți și metode

Subiecte de studiu

O sută patruzeci și una de femei care au fost diagnosticate cu HT în ambulatoriu pentru boli endocrine și metabolice de la Universitatea Medicală Cerrahpasa din Istanbul au fost incluse în acest studiu. Grupul de control a fost format din o sută cincizeci de femei sănătoase, cu o vârstă medie similară. Criteriile de excludere pentru participarea la studiu au inclus sarcina, fumatul, utilizarea medicamentelor eliberate pe bază de prescripție medicală sau pe bază de rețetă și având o boală autoimună care ar putea afecta rezultatele studiului.

Deși turcii sunt diverse din punct de vedere etnic, toate cazurile și controalele au fost atent selectate de partea europeană a Istanbulului pentru a se asigura că toți indivizii sunt de origine turcă. Toți participanții la studiu nu au avut nicio legătură și au furnizat consimțământul informat semnat înainte de colectarea probelor și a datelor. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică Instituțională al Școlii de Medicină Cerrahpasa, Universitatea din Istanbul.

Genotiparea polimorfismelor PARP-1

ADN-ul genomic de la subiecții studiați a fost izolat folosind metoda de precipitare a etanolului. Concentrația și puritatea ADN-ului sunt măsurate pe spectrometre NanoDrop (NanoDrop Technologies Inc., Wilmington, DE, SUA) și determinate folosind o densitate optică de 260/280 nm. Genotipurile PARP-1 C410T și G1672A au fost determinate folosind o metodă de polimorfism de lungime a fragmentului de restricție (RFLP). Primerii utilizați pentru amplificarea siturilor polimorfe au fost F: 5'-TCCAGTGGCACTATCAT-3 'și R: 5-GTTGTGAGACATAGGCCGAATC-3' pentru rs2793378 și F: 5'-GCGAGACCCTGTCCCTAA-3 'și R: 5-TCCCCTTTTTTTTTTTTTTTTTT 16

Produsele de amplificare au dat un fragment de 298 de baze de perechi (bp) pentru rs2793378 și un fragment de 187 bp pentru rs7527192. Zece microlitri ai produsului de amplificare de la rs2793378 au fost digerați cu o unitate de Hpy31 (Dde I) (New England Biolabs, Beverly, MA, SUA), incubată timp de 12 ore la 37 ° C și electroforizată timp de 30 de minute la 120 V. pe 3 % agaroză. gel. Homozigoza alelei comune (reprezentată de genotipul CC) a fost indicată de benzile 145 și 109 bp, în timp ce homozigoza variantei alelei (reprezentată de genotipul TT) a fost reprezentată de benzile 127 și 109 bp. Zece microlitri de produs de amplificare rs7527192 au fost digerați cu o unitate de Bsh1236I (BstUI) (MBI, Fermentas, Vilnius, Lituania), incubat timp de 12 ore la 37 ° C și separat pe un gel de agaroză 3%. Homozigoza alelei comune (reprezentată de genotipul GG) a fost indicată de benzile 152 și 35 bp, în timp ce homozigoza variantei alelei (reprezentată de genotipul AA) a fost reprezentată de o singură bandă de 187 bp, deoarece acest polimorfism distruge site de restricție pentru Bsh1236I. 20

Pentru rs1136410, condițiile PCR au fost stabilite la 95 ° C timp de 4 minute pentru denaturare, urmate de 35 de cicluri de 94 ° C timp de 30 s, 62 ° C timp de 45 s și 72 ° C timp de 45 s pentru etapa de recoacere, urmată de o prelungire finală la 72 ° C timp de 10 minute. Primerii utilizați sunt după cum urmează: primerul direct 5'-TGAGGAAGGCCTGACCCTGT-3 'și primerul invers 5'-TGACCAGCAGGAGGGTTTGC-3'. Modificările secvenței pentru rs1136410 au fost determinate folosind secvențierea bidirecțională. Secvențele de amplicon au fost evaluate folosind CLC workbench 3.6.1 (Danemarca).

Analiza haplotipului

Haplotipurile au fost generate din date genotipice. Analizele de dezechilibru obligatoriu (LD) și haplotip au fost efectuate folosind Haploview 4.2, care utilizează algoritmul de maximizare a așteptărilor (EM).

Prelucrarea și analiza datelor

Rezultatul

Populația de studiu

Un total de 141 pacienți cu tiroidită Hashimoto în vârstă de 39 până la 55 de ani (medie, 48,9 ani) și 150 de martori cu vârsta cuprinsă între 37 și 54 de ani (medie 46,6 ani) au fost înrolați în acest studiu. Nu a existat nicio diferență semnificativă între vârstele cazului și controale.

Nivelurile medii de hormon stimulator tiroidian (TSH), antiTPO și anticorp antiTG la pacienții cu HT în acest studiu s-au dovedit a fi de 8,3 ± 6, 8 μIUU/ml, 806, 7 ± 447, 3 UI/ml și 382, ​​7 ± 207,4 UI/ml. Nivelurile de anticorpi TSH, AntiTg și AntiTPO la subiecții martori au fost de 2,8 ± 1, 2 UI/ml, 65,4 ± 59,7 UI/ml și 27 ± 15,8 UI/ml. Nivelurile de anticorpi de TSH, AntiTPO și AntiTG la pacienții cu HT au fost statistic mai mari decât grupul de control decât se aștepta (P = 0, 0305, 0, 0296, 0, 0242).

141 de pacienți cu HT și 150 de subiecți martori au fost testați pentru rs2793378, rs7527192 și rs1136410. Nu au existat diferențe semnificative statistic între pacienți și martori în ceea ce privește vârsta medie (41,1 ± 11,7 ani, P = 0,352), sex (toate femeile, P = 0,881) și etnie (turcă), ceea ce indică faptul că frecvența corespunzătoare între grupuri.

Distribuția PARP-1 SNP în HT

Distribuția genotipurilor rs2793378, rs7527192 și rs1136410 în grupul de control a fost în HWE. Distribuția genotipului și frecvența alelelor tuturor polimorfismelor examinate sunt prezentate în Tabelul 1.

Tabel în dimensiune completă

Am găsit o asociere semnificativă între PARP-1 rs1136410 și rs7527192 și HT. Frecvența genotipului heterozigot TC rs1136410 a fost semnificativ mai mare la martori comparativ cu pacienții (OR: 2, 504, 95% CI: 1, 48-4, 23, P = 0,001). În plus, frecvența alelei C rs1136410 sa dovedit a fi statistic mai mare în grupul sănătos (OR: 1.632, 95% CI: 1, 1-2, 403, P = 0,013) și rs1136410 și-a păstrat semnificația după corectarea Bonferroni. Frecvența genotipului heterozigot GA rs7527192 a fost semnificativ mai mare la martori (OR: 1, 633, 95% CI: 1, 017-2, 623, P = 0,042) decât la pacienți. În plus, frecvența alelei A rs7527192 sa dovedit a fi statistic mai mare în grupul sănătos (OR: 1, 492, 95% CI: 1, 039-2, 122, P = 0,03); deși nici genotipul GA, nici alela A din rs7527192 nu și-au păstrat semnificația după corectarea Bonferroni. În plus, alela C a rs1136410 nu a arătat nicio semnificație după corecția Bonferroni, iar PARP-1 rs2793378 nu a prezentat niciun efect protector sau periculos în boala HT. Toate rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1.

Analiza haplotipului PARP-1 SNP

De asemenea, am examinat dacă aceste trei polimorfisme se aflau în dezechilibru de legare și orice haplotipuri comune asociate cu boli și haplotipuri rare (cu o frecvență de 5%).

Prevalența haplotipului CGC a fost semnificativ mai mare la martori (raportul caz-control: 0,061: 0, 146, P = 0, 0252, x 2 = 5,01), așa cum se arată în tabelul 2. Primul marker al haplotipului CGC, C - Alela este de tip sălbatic pentru RS2793378. Al doilea marker al haplotipului CGC, alela G, este de tip sălbatic pentru rs7527192. Al treilea marker, alela C, este mutant pentru rs1136410. Diferența s-a bazat pe un al treilea marker, alela C rs1136410, care servește ca factor de protecție. Cu toate acestea, deoarece acest studiu sa bazat pe o dimensiune mică a eșantionului, am folosit corecția Bonferroni pentru a reduce eroarea de tip I. După corectarea Bonferroni, analiza haplotipului nu a arătat nicio semnificație. În plus, doi SNP-uri din PARP-1 (rs1136410 și rs7527192) erau în LD puternic (Figura 1).

snps

Perechi de nepotrivire a diagramei de neechilibru pentru SNP-urile PARP-1 examinate. O valoare mai mare de r 2 indică o culoare mai închisă. Poziția site-ului cromozomului PARP-1 rs2793378 este 226597341, site-ul rs7527192 este 226596079 și site-ul rs1136410 este 226555302.

Imagine la dimensiune completă

Analiza combinată a genotipurilor SNP PARP-1

Tabelele 3, 4, 5 rezumă studiile de asociere între genotipurile combinate ale celor trei SNP și riscul general pentru HT. PARP-1 rs2793378 și rs7527192 SNP au arătat semnificație statistică între genotipurile combinate la pacienții cu HT și martori. Frecvențele combinate ale genotipurilor CC/GA, CT/GG și TT/GA au fost semnificativ mai mari în grupul martor comparativ cu grupul HT comparativ cu genotipul CC/GG combinat (OR: 2, 956, 95% CI: 1, 114-7, 840, P = 0,027, SAU: 2,66, 95% CI: 1, 13 - 6, 259, P = 0,023, SAU: 4, 644, 95% CI: 1, 455 - 14, 822, P = 0, respectiv 007). După corectarea Bonferroni, doar genotipul combinat TT/GA a rămas semnificativ și sa dovedit a fi un factor de protecție semnificativ împotriva bolii HT (P = 0,007), așa cum se arată în Tabelul 3.

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

În afară de rezultatele de mai sus, nu au existat alte diferențe semnificative între comparațiile multiple ale rs7527192-rs1136410 și rs2793378-rs1136410 la pacienții cu HT și controale (Tabelele 4 și 5).

discuţie

Pe baza studiilor de asociere a tiroidei (GWAS), este clar că factorii genetici sunt un factor important în funcția tiroidiană și autoimunitatea. Recent, s-a constatat că o variantă intronică a VAV3 (factor de schimb nucleotidic de guanină vav3, rs12126655) este asociată cu concentrații de TSH, iar o altă variantă (rs2071403) localizată la 75 bp proximal de site-ul de traducere TPO inițial a fost semnificativ asociată cu anticorpul plasmatic anti-TPO . O altă variantă intronică a HLA-DPB2 (rs733208) a fost, de asemenea, asociată cu pozitivitatea anticorpilor anti-TPO. 21 Eriksson și colab. 22 au demonstrat o asociere între hipotiroidism și boala tiroidiană autoimună cu SNP în regiunile HLA clasa I și II (rs2517532 și respectiv rs2516049) și în vecinătatea CAPZB (proteina de închidere (fibra de actină) a mușchiului liniei Z, beta, rs1209EB47 Gs) fosfodiesteraza 8B, rs4704397) și CTLA-4 (antigenul celulelor T toxice-4, rs231779). Pe baza studiilor genetice candidate, CTLA-4 este cunoscut a fi asociat pe scară largă cu multe alte boli autoimune, inclusiv hipotiroidismul autoimun.

În plus, variante precum FOXE1, un factor de transcripție tiroidiană, au fost identificate ca factori genetici de risc pentru hipotiroidismul primar. În GWAS de la FoxE1, s-a sugerat că FoxE1 și PARP-1 participă la complexul represor NIS uman, care este un represor transcripțional transactiv găsit în celulele carcinomului tiroidian care conține PARP-1 și funcționează prin poli (activitate ADP-ribozil). . Prin urmare, PARP-1 este o genă candidată puternică și adecvată pentru identificarea asocierilor dintre factorii genetici în autoimunitatea tiroidiană.

Mai multe studii susțin cu tărie faptul că PARP-1 joacă un rol important în bolile inflamatorii autoimune. Inhibitorii PARP-1 sau delețiile PARP-1 sunt utilizate în multe abordări terapeutice care se bazează pe blocarea țesuturilor sau inflamația sistemică. 28, 29 Recent, au fost propuse căi alternative care implică capacitatea PARP-1 de a regla transcripția genelor asociate cu inflamația. Mai multe publicații recente indică faptul că proteina nucleară PARP-1 reglează transcrierea și sinteza mediatorilor inflamatori. În plus, relația dintre activitatea PARP-1 și inflamație a fost investigată pe larg, iar asocierea cu inflamația a fost ferm stabilită prin inhibarea farmacologică a activității PARP-1, care a ameliorat răspunsul inflamator. 6, 30 Inhibarea activității PARP-1 este protectoare într-o gamă largă de afecțiuni inflamatorii, cum ar fi bolile cardiovasculare, diabetul, artrita reumatoidă și accidentul vascular cerebral. 13, 31 Prin urmare, gena PARP-1 poate fi un candidat puternic pe baza observațiilor făcute la șoareci knockout și oferă abordări terapeutice promițătoare pentru bolile inflamatorii care utilizează inhibitori PARP-1. .

Alternativ, concentrația de proteină PARP-1 este controlată prin reglarea directă a activității promotorului. Prin urmare, polimorfismele din regiunea promotorului pot afecta, de asemenea, activitatea PARP-1. Au fost identificate mai multe site-uri de transcripție în regiunea promotorului, precum și 3 seturi de cutii CCAAT/TATA care oferă un site de legare pentru factorii de transcripție YY1. În plus, patru variații ale secvenței au fost identificate în această regiune: rs2793378, Pol (A) n, C1362T și rs7527192. 16, 20 Potrivit lui Infante și colab., 32 polimorfismul C410T, care se află într-o stare heterozigotă, a crescut riscul bolii Parkinson, în timp ce heterozigoza rs7527192 a întârziat semnificativ debutul bolii. În acest studiu, nu am găsit nicio semnificație în raport cu rs2793378.

Recent, rs2793378, rs7527192 și rs1136410 au fost studiate în multe boli inflamatorii autoimune, inclusiv RA, 16 AR, 33 astm, 34 nefrită și artrită la pacienții cu LES 35 și boala Alzheimer, 36, 37, așa cum este descris mai sus. În studiul nostru, s-a constatat că genotipul heterozigot GA PARP-1 rs7527192 are un efect protector asupra bolii HT la populația turcă. Acest lucru este comparabil cu rezultatele Infante și colab., Care au arătat că anumite variații ale promotorului (rs2793378 și rs7527192) sunt asociate cu protecția împotriva bolii Parkinson. De asemenea, am constatat anterior că genotipul heterozigot rs7527192 a fost semnificativ asociat cu susceptibilitatea la rinita alergică (AR) la populația turcă. În plus, în acest studiu, conform mai multor comparații ale genotipurilor combinate rs2793378 - rs7527192, frecvența genotipului combinat TT/GA a fost semnificativ mai mare la controale comparativ cu grupul HT comparativ cu genotipul combinat CC/GG. După corectarea Bonferroni, doar genotipul TT/GA a continuat să arate semnificație ca factor de protecție. Când s-au combinat forma mutantă a rs2793378 și forma heterozigotă a rs7527192, s-a observat un efect protector semnificativ la pacienții cu HT.

De asemenea, s-a demonstrat că haplotipurile promotorului PARP-1 sunt asociate cu susceptibilitatea la anumite boli inflamatorii cronice, cum ar fi AR, RA și boala celiacă. De asemenea, a fost detectat efectul protector al haplotipului polimorfismului genei PARP-1 asupra bolii Alzheimer. 37 de haplotipuri rs2793378, rs7527192 și rs1136410 nu au fost asociate cu un risc crescut de RA. 33 Conform lui Pascual și colab. Cele 16 haplotipuri ale PARP-1 (-410, -1327, repetare microsatelite CA) joacă un rol în sensibilitatea RA la populația spaniolă, în timp ce varianta rs7527192 nu pare să facă parte din acest haplotip. Deși s-a constatat că haplotipul CGC are un efect protector bazat pe alela C (Ala) rs1136410, nu a supraviețuit corecției Bonferroni.

rs1136410 este prezent la aproximativ 5-33% din populația totală. 19 Am raportat anterior că alela T (Val) a rs1136410 este asociată cu un risc crescut de astm. În plus, rs1136410 a fost în mod semnificativ asociat cu boli cardiace ischemice, care este, de asemenea, un proces inflamator. 39 Hur și colab. 35 a demonstrat că varianta nesimțită + 40329T → C (V762A) a fost, de asemenea, asociată semnificativ cu un risc crescut de artrită la pacienții coreeni cu LES. Cu toate acestea, conform lui Onaran și colab., 40 rs1136410 nu a fost asociat cu un risc de artrită reumatoidă. S-a constatat, de asemenea, că variantele Val762 PARP-1 rs1136410 cresc riscul polineuropatiei diabetice la pacienții cu diabet de tip 1. În plus, am constatat că genotipul heterozigot TC (Val/Ala) rs1136410 a avut un efect protector asupra sensibilității HT la populația turcă chiar și după corecția Bonferroni.

Se consideră că PARP-1 și factorul nuclear kappa B (NF-κB) joacă un rol important în bolile inflamatorii. S-a demonstrat că PARP-1 poate acționa ca un coactivator al NF-κB în ceea ce privește procesele inflamatorii din celulă. Aceste descoperiri ne-au oferit noi perspective asupra patogeniei diferitelor boli inflamatorii, cum ar fi HT. Am raportat anterior că frecvența alelei de ștergere NF-κB rs28362491, care însoțește niveluri ridicate de interleukină-6 (IL-6), a fost semnificativă în grupul de pacienți cu HT. 43 Acest studiu se bazează pe cercetările noastre anterioare.

În plus, trebuie avut în vedere faptul că dimensiunea redusă a eșantionului, care ar fi putut afecta puterea statistică a analizelor noastre, poate fi considerată o limitare a acestui studiu. Deși un studiu cu putere statistică redusă are șanse reduse de a dezvălui un efect real, studiile caz-control cu ​​dimensiuni mici ale eșantionului sunt încă utilizate pe scară largă și pot fi utilizate pentru a evalua zonele candidate identificate anterior în eșantion și pentru a identifica mai precis obiectivele de selecție., eșantion mai mare sau studiu de replicare oferă certitudine pentru studii ulterioare.

PARP-1 este necesar pentru activarea mai multor factori de transcripție prin inflamația mai multor mediatori. S-a speculat că un mecanism diferit de legare și activare PARP-1 datorită genotipului heterozigot rs1136410 poate afecta expresia genelor implicate în răspunsul inflamator, posibil printr-o cale inflamatorie modificată. Prin urmare, acest polimorfism poate oferi un efect protector împotriva HT. Cu toate acestea, această ipoteză necesită în continuare investigații suplimentare.

Pe scurt, este posibil ca interacțiunile genelor PARP-1 să aibă un rol cheie în organizarea diferitelor modificări care apar în timpul răspunsului inflamator în boala HT. Cu toate acestea, sunt necesare studii de replicare sau alte studii funcționale cu dimensiuni mai mari ale eșantionului pentru a confirma rolul protector putativ al acestor variante de gene PARP-1. Mai precis, studii mai ample și studii de replicare care implică diferite grupuri etnice sunt recomandate cu tărie pentru a defini corect relația dintre polimorfismele PARP-1 (în special rs1136410 TC) și dezvoltarea HT, precum și prognosticul bolii.