răspuns

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Proprietățile biogeochimice ale probelor de apă
  • Efectele perturbării agricole și a timpului de prelevare a probelor asupra BCC
  • Identificarea familiilor cheie de bacterii pentru caracterizarea tulburărilor de mediu în timpul sezonului
  • Decaderea timpului pentru relația de similitudine
  • Legătura dintre structura bacteriană a comunității și proprietățile biogeochimice
  • Stochasticitate versus determinare în tulburarea mersului
  • Rețelele dezvăluie centre de interacțiune în rețea
  • discuţie
  • metode
  • Locul de studiu și eșantionarea
  • Extracția ADN-ului, amplificarea genei bacteriene 16S rRNA și piroseqüențierea
  • Prelucrarea datelor pirozecvențiale
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

abstract

Rezultatul

Proprietățile biogeochimice ale probelor de apă

Temperatura apei a scăzut monoton în timpul perioadelor noastre de eșantionare (Fig. S1), care a fost în concordanță cu tendința de temperatură din trei sezoane. Nivelurile de nutrienți, cum ar fi carbonul organic dizolvat (DOC), cererea chimică de oxigen (COD), azotul anorganic dizolvat (DIN) și PO 4 3–, au fost în general mai mari la locul de creștere a peștilor decât la locul de control (Figura S1). ) indicând prezența unui mediu bogat în nutrienți în ferma piscicolă. În plus, pentru o variabilă de apă dată, schimbarea orei între cele două situri a fost similară; de exemplu, nivelul COD a atins maximul în toamnă, în timp ce conținutul total de fosfat (TP) a crescut constant în ambele sezoane (Fig. S1).

Efectele perturbării agricole și a timpului de prelevare a probelor asupra BCC

Eforturile de secvențiere au dat patru eșantioane cu date de calitate scăzută de la W148C și W148F; aceste patru probe au fost, prin urmare, eliminate din analiza ulterioară. Un total de 239.335 de citiri au rămas după filtrarea calității în restul de 44 de probe, cu 3.873-7.177 secvențe bacteriene pe probă (medie = 5.439 ± 898). Filul/clasele dominante au fost Alphaproteobacteria (abundența relativă medie, 23,8%), Bacteroidetes (16,0%), Gammaproteobacteria (14,9%), Cianobacteria (14,2%), Actinobacteria (11,0%) și Betaproteobacteria (9,0%), care au reprezentat cumulativ 88,9% din secvențele bacteriene din toate probele. În general, cantitățile relative de Cianobacterii și Actinobacterii au scăzut, în timp ce Bacteroidetes, Gammaproteobacteria și Betaproteobacteria au crescut în trei sezoane (Fig. S2). Probele au fost grupate în funcție de timpul de prelevare și de habitate (ferma piscicolă și locul de control, cu excepția zilei 65), chiar și la acest nivel dur de clasificare (Fig. S2).

Biplocurile PCoA au arătat că separarea majoră a compoziției comunității bacteriobltonice (BCC) s-a bazat pe timpul de prelevare, deși a fost clar că a existat o distincție clară între locul de cultivare și control (Fig. 1). Acest model a fost confirmat în continuare de PERMANOVA, care a arătat că timpul de eșantionare a fost limitat la 19,3% (P 22, 26 au fost asociate pozitiv cu indicii de diversitate α bacteriană (Tabelul S2) și corelate semnificativ (testul Mantel, P = 0,001). Pentru Bdellovibrionales și P = 0,013 pentru Myxococcales) cu variații BCC.

Probele au fost codificate luând anotimpuri și habitate. S: vara; A: toamna; V: iarna; C: control; F: piscicultură. Numerele reprezintă intervalele de zile de la prima colectare.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Identificarea familiilor cheie de bacterii pentru caracterizarea tulburărilor de mediu în timpul sezonului

Diametrele cercurilor sunt proporționale cu incidența relativă medie (transformarea rădăcinii pătrate) a fiecărei familii la o locație dată pe parcursul a trei sezoane. S: vară, A: toamnă, W: iarnă, C: control, F: piscicultură.

Imagine la dimensiune completă

Decăderea timpului pentru relația de similitudine

Pentru a evalua efectele perturbărilor agricole asupra fluctuației timpului BCC, am estimat relația de asemănare a timpului pentru ferma piscicolă și locul de control separat. O decădere semnificativă a timpului pentru similitudinea BCC a fost găsită la ambele situri (P

Dezintegrarea timpului pentru relația de similitudine pentru comunitățile bacteriene din siturile de control (A) și siturile de creștere a peștilor (B). Rata de rotație w (panta de regresie) este estimată utilizând o regresie liniară (abordarea spațiului log-log) situată între valorile medii de similitudine pereche și intervalele de timp de eșantionare.

Imagine la dimensiune completă

Legătura dintre structura bacteriană a comunității și proprietățile biogeochimice

S-au găsit corelații semnificative între BCC și toate variabilele de mediu (P

Linia punctată indică aceleași sarcini pentru ambele. Sub linie, stohasticitatea domină și deasupra ei, determinarea domină. Numerele atribuite fiecărei linii indică creșterea procentuală a determinării.

Imagine la dimensiune completă

Rețelele dezvăluie centre de interacțiune în rețea

După cum sa sugerat anterior, ne-am concentrat asupra OTU-urilor de bază, care au fost găsite în mai mult de 50% din probe la fiecare sit 21, rezultând 189 OTU pentru control și 227 OTU pentru respectiv. Graficul rețelei a arătat că interacțiunile dintre bacteriile speciei au fost mai complexe și mai bine interconectate între speciile din ferma piscicolă decât la locul de control, deși s-a găsit un număr de modul mai mare la locul de control (Fig. 5). În plus, a existat un procent mai mare de asociații de specii pozitive în ferma piscicolă decât la locul de control (87,9% față de 80,5%). Acest model a fost validat în continuare de parametrii cheie ai topologiei rețelei, inclusiv conexiuni mai mari, grad mediu și factor de grupare și cale medie mai mică (Tabelul 3). Acest model relevă un număr mai mare de specii care interacționează, complexitate, o gamă mai mare de structuri de module și noduri mai apropiate în rețeaua 21 a comunității bacteriene de pescuit decât în ​​locul de control.

Grafic de rețea pentru comunitățile bacteriene ale sitului de control (A) și fermelor piscicole (B) cu structură submodulară utilizând metoda de modularitate rapidă lacomă 21. Fiecare nod reprezintă o OTU bacteriană. Culorile nodurilor indică OTU-urile asociate cu diferite plante majore de plante sau clase pentru Proteobacteria. Bordura albastră indică o interacțiune pozitivă, în timp ce marginea roșie indică o interacțiune negativă între două noduri individuale.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

discuţie

Pe scurt, întreruperea pe termen lung a creșterii plantelor diminuează foarte mult inversarea temporară a BCC, dar îmbunătățește interacțiunile dintre specii, adică interacțiunile ecologice îmbunătățite între grupurile bacteriene pentru a acomoda tulburările. Procesele deterministe în continuă creștere modelează dinamica temporală din cauza întreruperii mersului. Prin urmare, comunitatea bacteriană ar putea trece la o stare de echilibru alternativă ca răspuns la întreruperea pe termen lung. În plus, am identificat 14 familii de bacterii care au răspuns în mod consecvent la întreruperea nunții, deși BCC a fost foarte variabilă în trei sezoane. Studiul nostru oferă o perspectivă asupra mecanismelor de bază care modelează dinamica temporală a BCC, care este importantă în prezicerea răspunsurilor ecosistemului la perturbarea antropogenă. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pe o perioadă de ani până la decenii pentru a valida acest model.

metode

Locul de studiu și eșantionarea

Temperatura apei a fost înregistrată in situ. Oxigenul dizolvat (DO) a fost măsurat prin titrări Winkler 38. Nivelurile de DOC, azot total (TN), TP, NO 3 -, NO 2 -, PO 4+ și COD au fost analizate prin metode standard 41. Concentrația DIN a fost calculată ca sumă de NH 4 +, NO 3 - și NO 2 -. Chla a fost măsurată conform metodelor descrise anterior 11 .

Extracția ADN-ului, amplificarea genei bacteriene 16S rRNA și piroseqüențierea

În ziua prelevării, aproximativ 1 litru de apă a fost prefiltrat printr-o plasă de nailon (dimensiunea porilor 100 μm) pentru utilizare în extracția ADN-ului. Probele au fost apoi filtrate pe o membrană de 0,22 μm (Millipore, Boston, MA, SUA) pentru a obține biomasă microbiană. ADN-ul genomic a fost extras folosind un kit MOBIO Power Water ADN de izolare a ADN-ului (MP Biomedicals, Irvine, CA, SUA) conform protocoalelor producătorului. Extractele de ADN au fost cuantificate cu un spectrofotometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, SUA) și stocate la -80 ° C până la amplificare.

Un raport (50 ng) de ADN din fiecare probă a fost utilizat ca șablon pentru amplificarea bacteriană a genei ARNr 16S. Regiunea V4-V5 a fost amplificată folosind un set de grunduri specifice regiunii: grundul F515: GTGCCAGCMGCCGCGG, care conținea un adaptor de piroconsonare Roche 454 "A și o secvență unică de coduri de bare cu 11 baze și grundul R907: CCGTCAATTCMTTRAGTTT4, care conținea Roche 454 "A". Adaptor de secvență "B" la capătul 5 'al primerului 42. Pentru a reduce efectul amplificării PCR aleatorii, toate probele au fost amplificate în triplicat cu următoarele condiții de reacție: 30 de cicluri de denaturare la 94 ° C timp de 30 s, recoacere la 55 ° C timp de 30 s și extensie la 72 ° C timp de 30 ss, s extensie finală la 72 ° C timp de 10 minute 11. Produsele PCR pentru fiecare probă au fost combinate și purificate folosind un kit de purificare QIAquick PCR (Qiagen, GmbH, Hilden, Germania) și apoi cuantificate folosind un kit PicoGreen (Invitrogen, Carlsbad, CA, SUA). Cantitățile echimolare de produse PCR pentru fiecare probă au fost combinate într-un tub pentru analiza pe un piroconector Roche FLX + 454 (Roche Diagnostics Corporation, Branford, CT, SUA) pentru a obține direcții înainte (F515 cu cod de bare).

Prelucrarea datelor pirozecvențiale

analize statistice

Analiza principalelor coordonate (PCoA) și analiza similarității (ANOSIM) pe baza distanței ponderate UniFrac au fost efectuate pentru a evalua diferențele generale în BCC 48. Decaderea timpului pentru relația de similaritate (TDR) a fost utilizată pentru a evalua rata de rotație temporală a BCC 4. Pentru a testa dacă cifra de afaceri a TDR a fost diferită de zero, bootstrapping-ul a fost aplicat pentru a regresa variabilele care au încălcat ipoteza independenței 49. Rata a fost testată printr-un test t cu un eșantion între rata inițială și o medie a ratelor bootstrapped prin asocierea aleatorie a setului original. Analiza rețelelor ecologice moleculare (MEN) a fost utilizată pentru a evalua efectele perturbării mariculturii asupra interacțiunilor bacteriene dintre specii, utilizând o conductă accesibilă (//ieg2.ou.edu/MENA). Această abordare este remarcabilă prin faptul că rețeaua este definită automat și robustă la zgomot 21. Rețeaua a fost trasată în Cytoscape 3.1.1 50 .

Următoarele analize au fost efectuate folosind pachetele „vegane” și „ecodiste” din R (versiunea 3.0.2, //www.r-project.org). Analiza permutațională a varianței multivariate (PERMANOVA) cu funcția ADONIS a fost efectuată pentru a evalua cantitativ contribuția habitatelor (ferma piscicolă și locul de control) și timpul de eșantionare la variațiile BCC 51, 52. Pentru a determina factorii care au constrâns semnificativ BCC, variabilele de mediu au fost selectate printr-o selecție directă într-un model liniar multivariant (DistLM) 53. Contribuția fiecărei variabile de mediu a fost evaluată folosind „teste marginale” pentru a evalua semnificația statistică și contribuția procentuală a fiecărei variabile luate singure și apoi „teste secvențiale” pentru a evalua efectul cumulativ al variabilelor de mediu care explică variațiile din BCC 54. Analiza modelului nul a fost utilizată pentru a evalua cantitativ rolul proceselor de selecție deterministă în modelarea BCC 55, care a fost calculat ca proporție a diferenței dintre asemănarea observată și similaritatea așteptată în ipoteza nulă împărțită la similaritatea observată 56 .

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Xiong, J. și colab. Dovezi ale adaptării comunității bacterioplanctonului ca răspuns la tulburarea mariculturii pe termen lung. Știință. reprezentant. 5, 15274; doi: 10.1038/srep15274 (2015).