abstract

Rolul crescând al NHERF în fiziologia celulară. NHERF conține două domenii PDZ în tandem și foarte omoloage (aminoacizii 11-97 reprezintă PDZ-I - benzi diagonale) și aminoacizii 150-237 formează PDZ-II (model de țiglă), precum și o regiune C-terminală de aproximativ 30 amino acizi, se asociază cu membrii ERM familii de adaptoare membrano-cito-scheletice (tipar punctat). În timp ce multe proteine ​​celulare se leagă de PDZ-I, s-a demonstrat că mai multe proteine ​​se leagă de PDZ-II. NHE3 leagă regiunea conținută în capătul PDZ-II și C-terminal. Natura exactă a acestei asociații rămâne necunoscută. Relația structură-funcție pentru alte ținte NHERF, cum ar fi cotransportorul de tip IIA Na/Pi și cotransportorul Na/HCO3, trebuie explorată. Etichetarea metabolică indică faptul că NHERF este fosforilat constitutiv la serina-289 (prezentat ca stea)

nherf

Imagine la dimensiune completă

Dezvoltarea rolului NHERF în fiziologia celulară: de la transportul de ioni la transmisia semnalului

NHERF, adaptor membrana-cito-schelet. Studiile de reglare NHE3 în multe laboratoare indică un complex preformat de NHE3 cu NHERF și ezrin, care leagă complexul de citoscheletul de actină de sub membranele apicale. Esrin poziționează, de asemenea, PKA pentru a fosforila unul sau mai multe situri (prezentate ca stele) la capătul citoplasmatic al NHE3 pentru a reglementa activitatea de transport și reciclarea NHE3. Semnalele factorului de creștere mediate de proteina mică care leagă GTP, Rho, activează proteina kinază ROCK, care fosforilează situsul C-terminal (prezentat ca o stea) în ezrină, transformându-l din dimeri solubili inerți în adaptoare monomerice funcționale care se leagă la ambele NHERF și actină pentru reglare NHE3 și alte ținte

Imagine la dimensiune completă

Studii ulterioare au identificat o altă funcție pentru asocierea NHERF cu P2A, și anume de a defini soarta receptorului internalizat în timpul desensibilizării induse de agonist (Cao și colab., 1999). Datele sugerează că p2 AR asociat NH2F a fost mai ușor reciclat pe suprafața celulei în timpul resensibilizării. Cu toate acestea, asocierea NHERF a fost întreruptă de GRK-5 (o izoformă de receptor kinază cuplată cu proteina G) mediată de fosforilarea P2 AR în cadrul motivului de legare PDZ C-terminal. Acest lucru a dus la redirecționarea și degradarea receptorilor în lizozomi. Aceste studii au arătat că, așa cum se poate observa cu NHE3, NHERF joacă mai multe roluri în reglarea semnalizării receptorilor β-adrenergici.

NHERF, amplificator de semnal cu factor de creștere

NHERF, un nou rol în semnalizarea factorilor de creștere. Dimerizarea și activarea tirozin kinazei receptorului PDGF este facilitată sau stabilizată prin legarea la domeniul NHERF PDZ-I. Capacitatea NHERF de a forma homodimeri poate promova activarea PDGFR și iniția semnale mitogene prin căile PI 3-kinază și MAP kinază. Într-o manieră similară, NHERF dimeric poate facilita, de asemenea, asocierea canalului de calciu Trp4 cu izoformele Cp fosfolipază, care leagă NHERF PDZ-I, pentru a regla metabolismul calciului și fosfoinozita și pentru a activa semnalele protein kinazei C necesare pentru creșterea celulelor.

Imagine la dimensiune completă

NHERF: țintirea tirozin kinazelor fără receptor

În timpul desensibilizării p2 AR, o tirozin kinază fără receptor, c-Src, este încorporată în complexul receptor. Β-arestina, un modulator al fosfoproteinelor de semnalizare P2B și c-Src activat sunt necesare pentru a forma godeuri acoperite cu clatrin care promovează endocitoza AR β2 (Ahn și colab., 1999). Recrutarea c-Src declanșează, de asemenea, activarea ERK indusă de β-agonist și inițiază semnalizarea mitogenică. Deoarece NHERF se asociază selectiv cu p2 AR grupat (ref), poate exista o diafragmă între NHERF și β-arrestin, care leagă și coada citoplasmatică a p2 AR într-un mod dependent de agonist pentru a controla internalizarea și fluctuația. P2 AR și modulează semnalele mediate de c-Src care reglează creșterea celulară.

Metabolismul NHERF și fosfoinozidic

Observații recente conform cărora PDZ-II în NHERF-2/E3KARP leagă fosfolipaza Cp3 și potențează activitatea sa în mai multe linii celulare sugerează un rol important pentru NHERF în semnalizarea fosfoinozitidelor (Hwang și colab., 2000). Fosfolipaza Cp3 scindează PIP 2 în două molecule cheie de semnalizare, diacilglicerol și IP3. Activarea ulterioară a receptorului IP3 asociat reticulului endoplasmatic mobilizează depozitele intracelulare de Ca 2+ care, împreună cu diacilglicerolul, activează protein kinaza C și facilitează semnalizarea mitogenă. Creșterea calciului intracelular sau a vârfului de calciu la rândul său inițiază afluxul de Ca 2+ extracelular prin canalele de calciu (SOC), care sunt stocate în rezervoare, pe membrana plasmatică și umple rezervoarele interne epuizate. În acest fel, SOC joacă un rol important în reglarea calciului intracelular. Un raport recent sugerează că NHERF-1 PDZ-I se asociază cu două SOC-uri de mamifere, Trp4 și Trp5, precum și cu fosfolipazele Cpl și Cp2 (Tang și colab., 2000). Deoarece SOC și PLCβ coexistă în complex cu NHERF, el sugerează că NHERF ar putea combina funcțiile SOC-urilor cu PLCp (Figura 3) pentru a coordona metabolismul calciului și fosfoinozita și pentru a controla metabolismul și creșterea celulelor.

NHERF, principala țintă a proteinelor ERM

NHERF uman a fost izolat ca EBP-50 sau o proteină de legare a ezrinului de aproximativ 50.000 dolari (Reczek și colab., 1997) și leagă majoritatea membrilor familiei ERM de proteine ​​citoscheletice care leagă proteinele de membrană de citoscheletul actinic de bază. Proteinele ERM au definit, de asemenea, structurile membranei plasmatice, cum ar fi microvilele, situate pe suprafața apicală a celulelor epiteliale polarizate. Multe celule conțin homo- și heterodimeri inactivi ai ezrinei legați de alte proteine ​​ERM care nu sunt capabili să se lege nici de NHERF, nici de F-actină (Nguyen și colab., 2001). Cu toate acestea, factorii de creștere promovează fosforilarea reziduului C-terminal în ezrină (și moesină) fie prin proteina kinază activată de PKC0, fie prin RhoA, ROCK, și activează ezrina, transformându-l într-o formă monomerică care se asociază ușor cu NHERF Bretscher, 1999). Astfel, este interesant de remarcat faptul că Rho, dar nu proteinele mici care leagă GTP, Rac1 sau Cdc42, reglementează activitatea NHE3, probabil prin creșterea disponibilității proteinelor ERM prin creșterea fosforilării lor de către ROCK (Szaszi și colab., 2000).

Merlin, membru al familiei de proteine ​​adaptoare ERM și produs al genei neurofibromatozei 2 (NF2), este direct legat de reglarea creșterii. NF2 este mutat pe scară largă într-o boală ereditară dominantă care predispune pacienții la schwanoame și meningioame (Stokowski și Cox, 2000). Mutațiile NF2 umane sunt asociate cu morbiditate severă care reduce durata de viață a persoanelor afectate la mai puțin de 40 de ani. Merlin, ca și alte proteine ​​ERM, se leagă de NHERF prin domeniul său ERM N-terminal. Mai mult de 80% dintre mutațiile cauzatoare de boli găsite în domeniul ERM conduc la o afinitate semnificativ mai mică a proteinelor merlin mutante pentru NHERF și sugerează că NHERF joacă un rol cheie în activitatea supresoare tumorale a merlinului.

Esrin joacă, de asemenea, un rol permisiv în transformarea fibroblastelor mediată de ROCK de către oncogene Net și Dbl (Tran Quang și colab., 2000). Net și Dbl sunt ambii factori de schimb de nucleotide de guanină care promovează încărcarea GTP și activarea Rho. Formele oncogene sau hiperactivate de Net și Dbl duc la acumularea de Rho activat și la o creștere a semnalelor proliferative transduse de Rho. Efectele stimulatoare de creștere ale Rho-GTP necesită, de asemenea, fosforilarea capătului C-terminal și activarea ezrinei, iar ezrina mutantă, care nu are un sit critic de fosforilare, suprimă transformarea celulelor prin oncogene Net și Dbl.

Esrin este, de asemenea, supraexprimat și puternic fosforilat în fibroblaste transformate în cFos (Lamb și colab., 1997). În plus, supraexprimarea și fosforilarea ezrinului a fost corelată cu forma și motilitatea celulelor modificate, care reflectă probabil proprietățile invazive crescute ale celulelor maligne. Inactivarea cu laser a cromoforului (CALI) a esrinului duce la retragerea proeminențelor pseudopodiale cu accent pe rolul său în migrația celulară (Jay și Sakurai, 1999). Alte proteine ​​ERM, cum ar fi radixina și moesina, sunt reglate în jos în adenocarcinomul pulmonar în comparație cu țesutul pulmonar normal (Tokunou și colab., 2000). În cele din urmă, un nou membru al familiei ERM, Ehm2, este extrem de exprimat în celulele melanomului de șoarece (Shimizu și colab., 2000). Aceste studii sugerează că modificările profilului celular al proteinelor ERM și asocierea lor cu NHERF, o țintă majoră a proteinelor ERM în celulele epiteliale, pot promova transducția semnalelor care controlează creșterea și transformarea celulelor.

NHERF și cancerul uman

NHERF a fost identificat recent ca un ARNm care este extrem de indus de estrogen în celulele canceroase de sân pozitive ale receptorilor de estrogen (ER) (Ediger și colab., 1999; Stemmer-Rachamimov și colab., 2001). Estrogenul a crescut nivelul mARN-ului NHERF și al proteinelor în celulele MCF7 ER (+). În schimb, expresia receptorului de estrogen în celulele ER (-) a restabilit capacitatea estrogenului de a induce expresia NHERF în aceste celule. Aceste și alte experimente au definit NHERF ca o genă inductibilă de estrogen. Cu toate acestea, analiza directă a genei murine NHERF nu a reușit să identifice elementul (elementele) care răspunde la estrogen, iar mecanismul de reglare a NHERF de către estrogen rămâne necunoscut (Weinman și colab., 1999).

Analiza extinsă a celulelor cancerului de sân ER (+) și ER (-) umane a consolidat și mai mult legătura dintre expresia NHERF și creșterea dependentă de estrogen în cancerele de sân primare (Stemmer-Rachamimov și colab., 2001). Studiile imunohistochimice au arătat că expresia NHERF a crescut în tumorile mamare comparativ cu țesutul mamar normal adiacent, promovând astfel un rol pentru NHERF în dezvoltarea tumorii. În acest sens, semnalele PDGF sunt îmbunătățite în cancerele de sân uman și sunt implicate în progresia tumorii (Shao și colab., 2000). Datorită rolului propus de NHERF-1 și NHERF-2 în promovarea dimerizării PDGFR și activării semnalelor mitogene, expresia crescută a NHERF poate fi un factor care contribuie la proliferarea celulară în forme mai maligne de cancer de sân. În cele din urmă, gena NHERF umană este localizată pe cromozomul 17q25.1, o regiune care este frecvent mutată în cancerele de sân și ovarian uman (acces GenBank # NM_004252; Kalikin și colab., 1996, 1997). Deficiențele în expresia NHERF pot duce, de asemenea, la tulburări în semnalizarea creșterii și pot duce la cancer la om.

Modificările schimbului de Na +/H + joacă un rol în proliferarea pseudopodială a celulelor tumorale (Lagana și colab., 2000) și proliferarea celulară. NHE3, care este izoforma predominantă a NHE în celulele epiteliale, poate acționa împreună cu NHERF pentru a regla proliferarea și capacitatea invazivă a cancerelor de sân, ovariene și gastrointestinale.

Concluzii finale

S-au făcut progrese semnificative în ultimii ani în extinderea rolului NHERF la multe aspecte ale biologiei celulelor epiteliale. Dovezi în creștere indică, de asemenea, modificarea expresiei și/sau funcției NHERF în bolile umane, inclusiv hipertensiunea, insuficiența renală acută și cancerul de sân. Cu toate acestea, multe dintre proprietățile biochimice ale NHERF, precum cele enumerate mai jos, sunt încă slab înțelese.

Reglarea dimerizării NHERF

Conținutul de NHERF în țesutul renal depășește cu mult conținutul țintelor sale cunoscute și, deși numărul țintelor NHERF continuă să crească, există încă întrebări serioase cu privire la disponibilitatea tuturor NHERF celulare față de obiectivele sale. Tendința naturală a NHERF de a forma dimeri poate oferi indicații suplimentare pentru reglarea sa fiziologică. În timp ce noi dovezi sugerează că NHERF dimeric acționează pentru a regla unele ținte, cum ar fi CFTR (Ahn și colab., 2001) și PDGFR (Maudsley și colab., 2000), alte funcții, inclusiv reglementarea NHE3, pot utiliza NHERF monomeric. Studii recente sugerează că dimerizarea NHERF poate fi reglată prin fosforilarea proteinelor, deoarece tratamentul celulelor cu acid okadaic, un inhibitor de proteină serină/treonină fosfatază și un puternic promotor tumoral, reduce puternic dimerizarea NHERF (Shenolikar și colab., 2001). Mecanismele fiziologice care reglează dimerizarea NHERF pot juca, de asemenea, un rol important în dictarea disponibilității și funcției NHERF în celulele epiteliale.

Rolul fosforilării NHERF

Studiile de etichetare metabolică au arătat că NHERF este o fosfoproteină din celulele mamiferelor (Weinman și colab., 1995). Hall și colab. (1999) au arătat că GRK6A, o izoformă a receptorului kinazei cuplate cu proteina G, este o kinază NHERF majoră în celulele HEK293. Interesant este că GRK6A se leagă de NHERF PDZ-I (și PDZ-II) pentru a promova fosforilarea NHERF. Cu toate acestea, semnalele celulare care modulează absorbția GRK6A și fosforilarea NHERF sau rolul modificării covalente la serina-289 (Figura 1) pentru funcția NHERF sunt necunoscute.

Concurența între obiectivele NHERF

Dovezile experimentale arată că p2 AR (Hall și colab., 1998b) și CFTR (Ahn și colab., 2001) se leagă de PDZ-I, dar concurează în continuare cu NHE3, care se asociază preferențial cu PDZ-II și C-terminal al NHERF și crește astfel schimbul de Na +/H +. Pe măsură ce numărul țintelor NHERF crește, trebuie explorat rolul potențial al concurenței dintre țintele NHERF, și anume cele care implică fie PDZ-I, fie PDZ-II, precum și semnale fiziologice care modifică afinitatea NHERF pentru anumite ținte celulare, redirecționând funcțiile acestuia. .

Pe scurt, studii recente sugerează că NHERF reglează numeroase căi de semnalizare care sunt implicate în creșterea și funcția celulelor epiteliale. În plus, datele emergente indică NHERF ca un factor care contribuie la dezvoltarea cancerelor umane. Provocarea pentru studiile viitoare va fi definirea evenimentelor mediate de NHERF, care sunt esențiale pentru fiziologia celulară normală și elucidarea efectului expresiei și funcției aberante a NHERF în transformarea celulelor epiteliale.

Mulțumiri

Studiile NHERF din laboratoarele Weinman și Shenolikar sunt susținute de subvenții de la NIH DK55881 (EJ Weinman și S Shenolikar) și rapoarte ale veteranilor (EJ Weinman). JW Voltz este susținut de o comunitate prădătoare din Ministerul Apărării împotriva Cancerului de sân (DAMD-17-98-1-8070).