- abstract
- Principalul
- metode
- Prelevarea de probe.
- Analiza imunoblot a MCD, ACC și AMPK.
- Selectarea probei.
- Analiza datelor.
- REZULTATELE
- Demografia pacientului.
- Modificări legate de vârstă în expresia MCD.
- Modificări dependente de vârstă în expresia și fosforilarea ACC.
- Modificări legate de vârstă în expresia vârstei și fosforilarea AMPK.
- Efectele hipertrofiei miocardice asupra expresiei MCD și a expresiei și fosforilării ACC și AMPK.
- DISCUŢIE
- Restricții de studiu.
- glosar
abstract
După naștere, o scădere dramatică a nivelurilor de CoA în malonil duce la o maturare rapidă a oxidării acizilor grași. Am arătat anterior că scăderea malonil CoA se datorează creșterii activității malonil CoA decarboxilazei (MCD) și scăderii activității acetil CoA carboxilazei (ACC), enzime care degradează și sintetizează malonil CoA. Scăderea activității ACC corespunde activității crescute a protein kinazei 5'-AMP-activate (AMPK), care fosforilează și inhibă ACC. Aceste modificări sunt întârziate de hipertrofia miocardică. Deoarece rata oxidării acizilor grași poate afecta capacitatea inimii de a rezista daunelor ischemice, am examinat expresia MCD, ACC și AMPK în inima umană nou-născută. Biopsiile ventriculare au fost obținute de la copii supuși unei intervenții chirurgicale cardiace. Analiza imunoblot a arătat o corelație pozitivă între expresia MCD și vârstă. În contrast, s-a observat o corelație negativă între expresia ACC și AMPK și vârstă. Toate probele ventriculare au prezentat un anumit grad de hipertrofie, dar nu s-au găsit diferențe în expresia enzimei între hipertrofia moderată și severă. Acest lucru sugerează că expresia crescută a MCD și scăderea expresiei ACC și AMPK sunt regulatori importanți ai maturării oxidării acizilor grași în inima nou-născută a omului.
Principalul
Reglarea metabolismului acizilor grași în inimă. ACC este inactivat prin fosforilare de către P-AMPK. ACC activ catalizează carboxilarea acetil CoA la malonil CoA, care inhibă enzima care limitează rata acizilor grași mitocondriale, CPT-1. MCD catalizează decarboxilarea malonilului CoA în acetil CoA, eliminând astfel inhibarea CPT-1, (a) forma activă, (i) forma inactivă, (+) stimulează, (-) inhibă.
Imagine la dimensiune completă
Oxidarea acizilor grași din inimă poate fi afectată de diferite afecțiuni fiziopatologice, cum ar fi hipertrofia miocardică. La adulți, hipertrofia miocardică este asociată cu modificări dramatice ale metabolismului energetic, în special cu o tranziție la un fenotip glicolitic fetal (20-22). La nou-născut, hipertrofia miocardică întârzie maturarea oxidării acizilor grași datorită nivelurilor persistente de malonil CoA crescute, creșterii activității ACC și scăderii activității AMPK (17). Această întârziere în maturarea oxidării acizilor grași poate duce la inima nou-născută care se bazează pe glicoliză ca sursă primară de ATP și se observă o schimbare metabolică și la inima adultă hipertrofiată (20-22).
Hipertrofia miocardică poate apărea la pacienții pediatrici cu defecte cardiace congenitale, cum ar fi tetralogia fallotă (TOF), sindromul hipoplastic al inimii stângi (HLHS), defectele septului atrioventricular (AVSD), defectele septului ventricular (VSD) sau obstrucția tractului de evacuare ventriculară dreaptă. (RVOTO). Nu se știe dacă hipertrofia miocardică modifică expresia enzimelor care reglează nivelul Malonil CoA și, astfel, maturarea oxidării acizilor grași în inima umană nou-născută.
metode
Prelevarea de probe.
Cu acordul reprezentantului legal, 26 de eșantioane ale ventriculului miocardic drept cu dimensiuni cuprinse între 18 și 200 mg au fost prelevate de la sugarii supuși unei intervenții chirurgicale cardiace pentru a corecta defectele cardiace congenitale. Probele au fost obținute din probe normal rezecate și aruncate ca parte a procedurii chirurgicale. Au fost efectuate operații și s-au prelevat probe la Spitalul Universității din Alberta, Centrul de Științe ale Sănătății Walter C. Mackenzie din Edmonton, Alberta, Canada. Aprobarea etică a fost acordată de Consiliul etic pentru cercetarea în sănătate etică de la Universitatea din Alberta, dosarul nr. 4876. Toate țesuturile au fost imediat înghețate în N2 lichid și depozitate la -80 ° C până când au fost utilizate pentru analize biochimice.
Analiza imunoblot a MCD, ACC și AMPK.
Pentru analiza biochimică, 25 ± 2 mg de țesut au fost omogenizate într-un tampon conținând 0,05 M Tris-HCI, 0,25 M manitol, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 mM fluorură de sodiu, 5 mM pirofosfat de sodiu, 1 mM ditiotreitol. 0,1% (vol/vol) inhibitor al proteazei țesuturilor de mamifere (Sigma Chemical Co. Aldrich, Oakville, ON), 1% (vol/vol) cocktail cocktail fosfatază I (Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON), cocktail inhibitor fosfatază II ( Sigma Chemical Co.-Aldrich, Oakville, ON) și 10% (g/v) glicerol. Omogenatele au fost purificate prin centrifugare și supernatantul a fost colectat pentru analize biochimice. Proteinele au fost cuantificate utilizând metoda Bradford. Imunoblotii occidentali s-au efectuat așa cum s-a descris anterior (16). MCD a fost imunoblotată cu anticorp antiMCD (anticorp H2-40 preparat intern). ACC a fost imunoblotat cu anticorp anti-fosfo-ACC (Ser79) de iepure (Upstate Cell Signaling Technologies SUA, Charlottesville, VA) sau anticorp streptavivdin conjugat peroxidază (KPL, Gaithersburg, MA). AMPK a fost imunoblotat cu anticorp antiPhospho-AMPK (Thr 172) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) sau anticorp antiAMPK (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA).
Selectarea probei.
Deoarece hipertrofia miocardică poate reduce oxidarea acizilor grași într-o manieră proporțională cu severitatea sa (26), probele au fost stratificate pe baza severității hipertrofiei. Hipertrofia a fost clasificată de către chirurgii pediatri cardiaci ușori ca fiind ușoară, moderată și severă, luând în considerare tipul leziunii și vârsta pacientului. Unde a fost posibil, cuantificarea grosimii peretelui ventricular drept a fost efectuată utilizând ecocardiografie în modul M/bidimensională, fie în vizualizarea axei lungi, fie în cea scurtă, cu marginea anterioară la marginea anterioară la același nivel cu mușchii papilei ventriculare stângi la nivelul sfârșitul diastolei. În cazurile în care înregistrările ecocardiografice nu erau disponibile, hipertrofia a fost clasificată exclusiv în funcție de tipul leziunii și vârsta pacientului.
Analiza datelor.
Datorită dimensiunii mari a eșantionului, s-au efectuat 3 geluri pentru fiecare enzimă monitorizată (MCD, P-ACC, ACC, P-AMPK și AMPK). Există posibilitatea unor modificări ușoare în titrurile anticorpilor primari și secundari utilizați în imunoblotarea occidentală. Ca urmare, logaritmul pentru toate valorile brute a fost luat în considerare pentru orice prejudecată a datelor (figurile 2-4). Normalizarea pentru media ± SD pentru fiecare grup a fost efectuată pentru a elimina diferențele mici dintre gelurile individuale, permițând compararea directă. Astfel, s-a obținut o probă de 26 de probe cu probe de la sugari cu vârsta cuprinsă între 0,2 și 10 luni. Modificările dependente de vârstă ale expresiei enzimei au fost determinate prin analiza de regresie liniară. Dacă este necesar, rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Diferențele în expresia MCD, ACC și AMPK între hipertrofia clinică ușoară și severă au fost estimate folosind testul U Mann-Whitney. Rezultatele au fost considerate semnificative în p
Expresia normalizată a MCD în țesutul miocardic ventricular drept la sugarii cu vârsta cuprinsă între 0,2 și 10 luni (n = 26), care arată o creștere a expresiei MCD dependentă de vârstă (r = 0,42, p = 0,03). Insertul prezintă imunobloti occidentali reprezentativi.
Imagine la dimensiune completă
REZULTATELE
Demografia pacientului.
Un total de 26 de biopsii ventriculare drepte (10 eșantioane de la pacienți și 16 eșantioane de la bărbați) au fost obținute de la nou-născuți cu vârsta cuprinsă între 5 zile (0, 2 luni) și 10 luni care au fost supuși corecției chirurgicale a VSD, HLHS, AVSD, TOF. sau RVOTO (Tabelul 1). Aceste eșantioane au fost utilizate pentru a evalua modificările dependente de vârstă în expresia MCD, precum și modificările dependente de vârstă în expresia ACC și AMPK și fosforilarea. Toți pacienții au avut un anumit grad de hipertrofie miocardică. În general, pacienții cu RVOTO s-au dovedit a avea hipertrofie severă (Tabelul 1). Pentru a caracteriza efectele hipertrofiei miocardice asupra expresiei MCD, ACC și AMPK, a fost selectat un subset de pacienți (n = 5 per grup) de vârstă similară (vârstă mediană = 3,5 luni) cu hipertrofie moderată sau severă (vezi pct. 4.8). de mai jos).
Tabel în dimensiune completă
Modificări legate de vârstă în expresia MCD.
În primul rând, au fost evaluate efectele vârstei asupra expresiei MCD cardiacă, enzima responsabilă de decarboxilarea malonilului CoA în acetil CoA. S-a observat o creștere semnificativă (p = 0,03) dependentă de vârstă a expresiei MCD (Fig. 2), sugerând că pe măsură ce copilul se maturizează, creșterea expresiei MCD este probabil să scadă conținutul de malonil de CoA și astfel să dezinhibe CPT-1, rezultând efecte permisive asupra oxidării acizilor grași miocardici cu lanț lung. Cu toate acestea, din cauza disponibilității limitate a eșantionului, nivelurile de malonil CoA în biopsiile ventriculare nu au fost măsurate în acest studiu.
Modificări dependente de vârstă în expresia și fosforilarea ACC.
Mai mult, au fost evaluate efectele vârstei asupra expresiei cardiace ACC. Deși inima exprimă atât isoformele ACC de 265 kD, cât și 280 kD, predomină izoforma de 280 kD și nu am reușit să detectăm izoforma de 265 kD prin imunoblotarea occidentală. A existat o scădere semnificativă (p = 0,002), dependentă de vârstă a expresiei ACC (Fig. 3), sugerând că pe măsură ce inima se maturizează, o scădere a expresiei ACC poate reduce sinteza malonilului CoA. Deoarece ACC poate fi fosforilat la serină-79 și inhibat de AMPK, am măsurat, de asemenea, nivelurile de P-ACC cu un anticorp fosfo-specific. Nu a existat nicio modificare legată de vârstă a gradului de fosforilare ACC. Acest lucru sugerează că sinteza malonilului CoA și maturarea oxidării acizilor grași sunt cel mai probabil reglementate de nivelul de expresie al ACC și nu de starea de fosforilare a ACC în inima umană nou-născută.
Expresia normalizată a ACC în țesutul miocardic ventricular drept la sugarii cu vârsta cuprinsă între 0,2 și 10 luni (n = 26), care arată o scădere a vârstei în expresia ACC (r =, 0,66, p = 0,002). Insertul prezintă imunobloti occidentali reprezentativi.
Imagine la dimensiune completă
Modificări legate de vârstă în expresia vârstei și fosforilarea AMPK.
Pentru a investiga în continuare acest lucru, efectele vârstei asupra expresiei AMPK au fost evaluate în continuare. A existat o scădere semnificativă (p = 0,04) dependentă de vârstă a expresiei AMPK (Fig. 4). Nu a existat nicio modificare dependentă de vârstă a amplorii fosforilării (activării) AMPK, determinată prin normalizarea P-AMPK la cantitatea totală de AMPK detectată în fiecare probă de biopsie ventriculară.
Exprimarea normalizată a AMPK în țesutul miocardic ventricular drept de la sugari cu vârsta cuprinsă între 0-10 luni (n = 26), indicând o scădere dependentă de vârstă a expresiei AMPK (r =, 0,41, p = 0,04). Insertul prezintă imunobloti occidentali reprezentativi.
Imagine la dimensiune completă
Efectele hipertrofiei miocardice asupra expresiei MCD și a expresiei și fosforilării ACC și AMPK.
Toate exemplarele de biopsie ventriculară din acest studiu au arătat grade diferite de hipertrofie cardiacă (Tabelul 1). Un număr limitat de probe de biopsie ventriculară clasificate ca fiind hipertrofie clinică ușoară (n = 1) și moderată (n = 2) exclud orice analiză statistică a posibilelor modificări ale expresiei MCD, ACC și AMPK. Efectele hipertrofiei asupra expresiei MCD, ACC și AMPK au fost limitate la specimenele de biopsie ventriculară clasificate ca fiind hipertrofie clinică ușoară sau severă. Expresia MCD, ACC și AMPK a fost evaluată în două grupuri (n = 5 per grup) în intervalul de vârstă de 2-6 luni cu hipertrofie clinică ușoară sau severă (Tabelul 2). Nu s-a observat nicio diferență în expresia MCD, ACC sau AMPK între hipertrofia ușoară și severă. Cu toate acestea, la pacienții cu hipertrofie severă în comparație cu pacienții cu hipertrofie moderată (Tabelul 3), a existat o reducere semnificativă (p = 0,03) a raportului β-AMPK (activ) cu AMPK total.
Tabel în dimensiune completă
Tabel în dimensiune completă
DISCUŢIE
Acest studiu a examinat efectele vârstei și ale hipertrofiei miocardice asupra expresiei MCD cardiace, precum și asupra expresiei și fosforilării ACC cardiac și AMPK. Probele de biopsie ventriculară obținute de la pacienții pediatrici cu vârsta cuprinsă între 0,2 și 10 luni au crescut expresia MCD dependentă de vârstă. În schimb, în funcție de vârstă, ACC și AMPK au fost exprimate fără efecte dependente de vârstă asupra fosforilării oricăreia dintre enzimele din inima umană nou-născută. Hipertrofia (hipertrofie severă versus hipertrofie ușoară) nu a afectat expresia MCD sau expresia ACC și fosforilarea. Deși nu a existat nicio diferență semnificativă în expresia AMPK între hipertrofia severă și moderată, fosforilarea AMPK a fost redusă la debutul hipertrofiei severe. Aceste date sugerează că modificările expresiei MCD, ACC și AMPK sunt susceptibile să susțină modificări ale conținutului de malonil de CoA (neevaluate în acest studiu), în special în ceea ce privește maturarea oxidării acizilor grași în inima umană nou-născută în timpul îmbătrânirii. Aceste date sugerează în continuare că modificările în fosforilarea AMPK (adică activarea), dar nu și expresia AMPK, pot fi cauza diferențelor în rata de maturare a oxidării acizilor grași observate la diferite grade de hipertrofie miocardică la inima umană nou-născută.
Examinarea expresiei MCD a relevat o creștere dependentă de vârstă după naștere. Această expresie crescută este de natură să regleze maturarea oxidării acizilor grași, deoarece creșterea conținutului de MCD poate crește degradarea malonilului CoA și astfel dezinhibă CPT 1, enzima care limitează rata acizilor grași mitocondriali. Acest lucru este susținut de descoperirile anterioare din inima de iepure neonatală, unde există o reducere dramatică a conținutului de malonil CoA de la 1 la 7 zile, în concordanță cu o creștere de 10 ori a oxidării acizilor grași. Activitatea MCD singură nu se modifică din cauza diferențelor de livrare a acizilor grași către inima nou-născută (27). Deși nu am putut determina activitatea MCD în biopsiile ventriculare datorită naturii limitate a probelor, studiile anterioare au arătat că activitatea MCD crește odată cu creșterea vârstei inimii nou-născute (11). Deși acest studiu nu a evaluat expresia MCD (11), oferă sprijin pentru importanța potențială a modificărilor expresiei MCD care stau la baza modificărilor activității MCD și astfel reglează conținutul de malonil CoA și maturizarea oxidării acizilor grași în inima nou-născutului.
Exprimarea MCD, ACC și AMPK la un grup selectat de pacienți de vârstă similară nu a evidențiat nicio diferență între hipertrofia ușoară și severă. Hipertrofia a fost clasificată după vârstă și tip de leziune după biopsia cardiacă, când grosimea peretelui ventricularului drept nu a fost afectată de parametrii hemodinamici și de presiune cardiaci in vivo. Deși un raport anterior a descris o întârziere în maturarea oxidării acizilor grași în inimile porcilor cu hipertrofie neonatală (până la vârsta de 21 de zile) datorată parțial menținerii activității ACC și reducerii expresiei subunității α catalitice AMPK (17), absența specimenelor de biopsie ventriculară disponibile fără niciun grad de hipertrofie a împiedicat o astfel de hipertrofie.evaluarea în acest studiu. Interesant, expresia și amploarea fosforilării AMPK nu au diferit între hipertrofia moderată și severă în sine, dar a existat o scădere semnificativă a β-AMPK, deoarece s-a normalizat la cantitatea totală observată de AMPK. Acest lucru poate sugera că gradul de hipertrofie poate afecta fosforilarea și, astfel, activarea AMPK. Cu toate acestea, acest efect al hipertrofiei trebuie interpretat cu prudență, deoarece această diferență, deși semnificativă statistic, poate să nu fie relevantă din punct de vedere fiziologic, deoarece rezultă din modificări semnificative ale AMPK total și fosforilat între hipertrofia ușoară și severă (Tabelul 3).
Restricții de studiu.
În concluzie, acest studiu a demonstrat o creștere dependentă de vârstă a expresiei MCD, precum și o scădere dependentă de vârstă a expresiei ACC și AMPK în probele de biopsie ventriculară dreaptă obținute de la sugarii supuși unei intervenții chirurgicale pentru corectarea diferitelor defecte cardiace congenitale. Deoarece nu au existat modificări legate de vârstă în fosforilarea ACC și AMPK, acest lucru sugerează că nivelurile de expresie, mai degrabă decât activitatea, pot fi regulatori importanți ai maturării oxidării acizilor grași în inima umană nou-născută în prezența unor grade diferite de hipertrofie.,