obiecte

abstract

Pielea este un țesut excepțional îmbogățit cu lipide. Implicarea lipidelor pielii în întreținerea pielii și în homeostazia întregului corp este bine documentată 1, 2. În plus, disfuncția lipidică a pielii este asociată cu mai multe boli ale pielii, cum ar fi acneea, dermatita atopică și psoriazisul, cum ar fi cele majore 3, 4, 5, 6. Lipidele de la suprafața pielii (SSL) provin dintr-un amestec de lipide derivate din două surse majore de lipide ale pielii. Sebul, matricea lipidică amorfă secretată de glanda sebacee (SG) și lipidele epidermice din stratul cornos (SC) reprezintă principalele compartimente lipidice de pe suprafața pielii 7 .

Materiale și metode

Substanțe chimice, reactivi și compuși de referință

Eșantionarea stratului cornos uman

Stratum corneum (SC) a fost preluat din trei locuri diferite ale corpului la 10 voluntari caucazieni (8 femele și 2 bărbați, vârstă medie 37,5 ± 7,6 ani) prin dezbrăcarea repetată a benzii D-Squame ™ (CuDerm Corp., Dallas, TX, SUA). Voluntarii nu au prezentat semne de boală a pielii în niciuna dintre zonele eșantionate. Eșantioanele SC au fost prelevate de pe suprafața volară a antebrațului (ARM) și din zona centrală a frunții (HEAD) atât la panourile feminine, cât și la cele masculine, în timp ce SC a fost prelevată din zona centrală a pieptului (CHEST) numai la femei la părul corpului prezent la bărbați. Studiul a fost realizat în conformitate cu Declarația de la Helsinki după aprobarea de către Comitetul Central de Etică „Fondazione GB Bietti”, cu acordul scris al fiecărui voluntar.

pregătirea unei mostre

instrumentaţie

Aparatul cromatografic a constat dintr-o rezoluție HPLC de mare viteză din seria 1200 (Agilent Technologies, Germania) echipată cu un degazor, un autosampler și un termostat plasat într-un compartiment pentru coloane de la același producător. Pentru separare rapidă HPLC în fază inversă (RP), Kinetex C8, 50 x 2, 1 mm, 1,7 μm, secțiune de particule, 100 coloană de securitate cu secțiune de pori cu pre-coloană SecurityGuard ULTRA Cartuș (Phenomenex, Castel Maggiore, BO, Italia), s-a folosit contrapresiunea maximă de funcționare la 600 bari. Probele SC și standardele autentice au fost eluate cu un gradient binar de (A): 5 mM formiat de amoniu în apă conținând 20% metanol/izopropanol 95: 5 și (B): metanol/izopropanol 95/5. Fazele mobile au fost filtrate prin filtre de sticlă de 0,45 μm și continuu degazate în vid. Programul de eluare a fost după cum urmează: 0 - 6 min 60% B, 20 min 99% B, 20 - 30 min 99% B, 36 min 60% B, 36 - 38 min 60% B. După 2 min. la 60% B. Debitul a fost menținut la 0,4 ml/min pe tot parcursul procedurii HPLC și în timp (2 minute). Coloana a fost termostatată la 60 ° C. Volumul de injecție a fost de 4 pl. Acul de injecție a fost spălat cu faza mobilă într-un orificiu de spălare în terminalul HPLC. Efluentul eluant a fost conectat la doi analizatori MS diferiți pentru detectare și caracterizare.

Sursa ionilor de electrospray și timpul de zbor MS

Măsurătorile precise ale masei și ale izotopilor au fost efectuate cu un TOF-MS din seria G6220A (Agilent Technologies, Germania) echipat cu o interfață ESI care funcționează în modul ion negativ. Testele eluate din sistemul LC au fost încărcate pe un instrument TOF-MS la cromatografie de testare (a se vedea condițiile cromatografice). Azotul a fost folosit ca gaz de atomizare și desolvatare. Temperatura și debitul gazului de uscare au fost de 350 ° C și 10 l/min. Tensiunea capilară și conică a fost de 4.000 și 60 V. Spectrele de masă ale modului de scanare TOF au fost obținute în modul ion negativ folosind TOF la 10.000 de rezoluții de masă pentru scanare cuprinsă între 100 și 1200. Scanările MS au fost procesate utilizând software-ul Mass Hunter (versiunea B.01.03 ). Pentru a îmbunătăți măsurarea exactă a masei speciilor ionice, soluția de referință a fost evaporată într-un lot continuu într-o cameră de pulverizare. Datele rezultate au fost convertite în centrul de greutate al masei, din care a fost măsurată valoarea exactă a m/z. Analizele cantitative ale FFA și CHS au fost efectuate prin aceeași metodă LC-MS.

ESI-MS cu triplu cvadrupol MS

Spectrele ESI de masă tandem (MS/MS) au fost obținute cu un quadrupol triplu din seria G6410A (QqQ) (Agilent Technologies, Germania). Datele au fost obținute în modul ion pozitiv la rezoluția unității de masă prin scanarea ionilor între m/z 100 și 1200. Spectrele MS au fost mediate și procesate utilizând software-ul Mass Hunter. Testele eluate din sistemul LC au fost introduse într-un instrument QqQ la debitul de funcționare (a se vedea condițiile cromatografice). Azotul a fost utilizat ca gaz de atomizare și uscare și setările sursei au fost aceleași ca pentru TOF-MS. Pentru a identifica compusul, experimentele cu ioni de precizie au fost efectuate prin scanarea celui de-al treilea cvadrupol, în timp ce experimentele cu ioni de produs (prodION) au fost efectuate prin scanarea primului cvadrupol. Al doilea cvadrupol a fost utilizat ca celulă de coliziune în ambele experimente. Energia de coliziune utilizată a fost de 34 V, în timp ce tensiunea fragmentorului (F) a fost setată la 140 V.

Procesarea datelor

Extracția datelor HPLC-MS

Analiza datelor și statistici multivariate

Identificarea compusului

Identitatea compușilor găsiți semnificativi în clasa de separare detectată prin analize LC-MS a fost confirmată de LC-MS/MS efectuată cu un analizor de masă QqQ folosind dispozitivele descrise mai sus. Experimentele au fost repetate cu condiții cromatografice identice cu cele descrise pentru analiza primară. Ionii au fost vizați pentru fragmentarea fragmentării (CID) indusă de coliziune în QqQ pe baza unei mase exacte predeterminate și RT determinată de LC-MS. Compararea structurii compusului propus cu fragmentele obținute a confirmat identitatea. Datele de masă exacte și distribuțiile izotopului pentru precursorii și ionii de produs au fost studiate și comparate cu datele spectrale ale compușilor de referință, dacă sunt disponibili, obținute în aceleași condiții pentru confirmarea finală (HMDB, METLIN).

Analize cantitative ale acizilor grași liberi și sulfat de colesterol prin LC-MS

Pentru evaluarea cantitativă a FFA și CHS majore, diluții seriale 1: 1 ale soluției stoc conținând pmmol/L de FA C16: 1 autentică, FA C18: 1, FA C18: 2 și FA C24: 0 și 10 μmol/L CHS. Soluțiile standard au fost analizate prin LC-MS descris mai sus. Limita de detectare (LOD) și limita de cuantificare (LOQ) au fost calculate pe baza ghidurilor IUPAC 43. În special, LOD a fost determinat ca fiind cea mai mică concentrație care a avut un raport semnal-zgomot (S/N) de 3 ori mai mare decât semifabricatul. LOQ a fost definit ca cea mai mică concentrație la care a început liniaritatea. Liniaritatea a fost definită pe baza coeficientului de corelație (R). În plus, precizia, reproductibilitatea și randamentul zilnic și zilnic au fost determinate prin injectarea unei soluții de 50 și 5 μmol/l de FFA standard și CHS.

Disponibilitatea datelor

Fișierele de date create în timpul și/sau analizate în timpul studiului curent sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere rezonabilă.

Rezultatul

Testarea semnificației și analiza componentelor majore

După aliniere și normalizare, proprietățile au fost filtrate prin selectarea subiecților care erau prezenți în 100% din probe din orice grup experimental, cum ar fi ARM, CHEST și HEAD. Peste o mie (1098) de subiecți au fost găsiți în numărul total (100%) de probe SC. Diferențele dintre SC pentru toate cele trei grupuri au fost evaluate pentru metaboliții individuali de către ANOVA (cu p

sebacee

(A) Analiza componentelor principale (PCA) și (B) Parcele CC ale entităților găsite în probe de 100% din cel puțin o afecțiune din extractele lipidice de ARM, piept și strat de corneu HEAD (SC). În cadrul primelor două componente principale (PC) s-a explicat 50,77% din varianța totală, cu 38,93% în prima dimensiune și 11,84% suplimentar în a doua dimensiune. Graficele CC arată valorile P-Cor și P-Cov ale entităților atribuite ca ceramide (puncte roz), acizi grași liberi (puncte verzi) și compuși înrudiți cu sulfatul de colesterol (puncte roșii) printre entitățile detectate în probe 100% în cel puțin o condiție (puncte negre).

Imagine la dimensiune completă

Pliază modificările și gruparea

Imagine la dimensiune completă

O grupare ierarhică de 52 de subiecți care a fost modificată în mod obișnuit atunci când se compară ARM cu piept, piept cu cap și ARM cu cap, așa cum se arată în FIG. 2. Identitatea FFA adnotat și a sulfatului de colesterol a fost confirmată prin comparație cu spectrele RT și MS/MS ale respectivului compus autentic. Adnotările de ceramidă au fost confirmate după generarea spectrelor MS/MS.

Imagine la dimensiune completă

Profiluri de distribuție a acizilor grași liberi în SC din antebraț, piept și frunte

Analiza cantitativă a principalilor acizi grași liberi din SC și sulfat de colesterol prin LC-MS

Pentru a determina nivelurile de CHS și numărul principalelor caracteristici FFA ale sebumului și lipidelor bariere lipidice epidermice, cum ar fi FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 și FA C24: 0, o metodă cantitativă bazată pe separarea RP-HPLC și a fost setată detectarea MS în modul ion negativ. Liniaritatea, LOD, LOQ și forma de regenerare a matricei au fost evaluate pentru standarde autentice de analit țintă. Metoda a fost optimizată pentru cuantificarea FA C16: 1, FA C18: 1, FA C18: 2 și FA C24: 0 și CHS în SC din ARM, CHEST și HEAD. FFA și CHS au fost cuantificate în raport cu standardele interne deuterizate d14-PoA și d7-CHS. Condițiile definite au demonstrat liniaritate, reproductibilitate, randament, sensibilitate și LOQ satisfăcătoare, așa cum se arată în Tabelul S4. Pentru a normaliza rezultatele la greutatea probei SC, cantitățile cantitative au fost împărțite la proba de mg. Concentrațiile țintă de FFA cuantificate în SC au fost în concordanță cu procentele relative observate pentru ARM, CHEST și HEAD în abordarea ne-vizată. După cum rezultatele cantitative prezentate în FIG. 4 ca nmol/mg SC, FFA specific sebumului, cum ar fi FA C16: 1, a crescut în ordinea ARM

Rezultatele evaluărilor cantitative ale biomarkerilor de secreție de sebum și ale lipidelor de barieră a permeabilității epidermice în extractele de lipide ARM, CHEST și HEAD SC. FFA și CHS au fost cuantificate prin LC-MS, în timp ce nivelurile de colesterol și squalen au fost evaluate prin GC-MS. Graficele cutiei arată concentrația exprimată ca nmol/mg SC în ARM (cutie verde), PIEȚĂ (cutie portocalie) și HEAD (cutie gri). Rezumatul tabelului din figură arată concentrația medie indicată de o cruce roșie în graficul de câmp relevant și semnificația evaluată de ANOVA.

Imagine la dimensiune completă

Analiza cantitativă a colesterolului și a squalenului în SC utilizând GC-MS

Pentru a confirma diferențele observate în cantitățile relative de lipide epidermice și lipide sebacee în funcție de distribuția SG, biomarkerii respectivi, și anume colesterolul și squalenul, au fost cuantificați prin GC-MS pe alicote din aceleași extracte SC analizate anterior prin LC-MS. Rezultatele cantitative sunt raportate ca colesterol nmol și squalen pentru mg SC în FIG. 4 împreună cu analize cantitative LC-MS ale FFA și CHS. ANOVA a demonstrat că nivelurile de colesterol au fost semnificativ reduse de la zone sărace în SG la zone bogate în SG. În schimb, s-a observat o creștere semnificativă a concentrației de squalen atunci când HEAD a fost comparat cu siturile ARM și CHEST.

discuţie

Lipidomica pe scară largă a pielii a arătat o variație largă intra-individuală a SSL în funcție de aria regională a corpului la om36. Regiunile frontală, frontală, mamară și umăr au prezentat un profil lipidic pronunțat în comparație cu orice alt loc al corpului datorită amprentei sebacee, care a fost în cea mai mare parte asociată cu niveluri mai ridicate de trigliceride și digliceride 36. Condițiile noastre analitice au fost selectate pentru a detecta în mod optim lipidele barierei epidermice, cum ar fi ceramidele și CHS, împreună cu FFA. Abundența membrilor specifici ai familiei FFA este un semn distinctiv al matricei SPB și sebumului. În mediul nostru, FFA a fost semnătura cea mai proeminentă a lipidelor sebacee. Rezultatele noastre au fost în concordanță cu observarea diferitelor organizații structurale ale lamelelor lipidice derivate din corneocite din picior și frunte, unde conținutul de sebum a fost detectat la niveluri scăzute (1 µg/cm 2) și ridicate (200 µg/cm 2), 60 . Spectroscopia Raman a arătat că conținutul de lipide a fost crescut în derma pielii bogate în SG comparativ cu pielea săracă în SG, demonstrând absorbția componentelor sebumului de către epidermă și țesutul inferior. .

Mulțumiri

Studiul a fost realizat ca parte a unui program de cercetare de bază finanțat de Ministerul Sănătății din Italia.