obiecte
abstract
Atorvastatina este un medicament utilizat în mod obișnuit pentru scăderea colesterolului pentru tratamentul hipercolesterolemiei. Inhibă 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A reductază (HMG-CoA), o enzimă care catalizează etapa de limitare a ratei de sinteză a colesterolului 11. Din câte știm, niciun studiu publicat nu a fost asociat cu modificări GM cu tratamentul cu atorvastatină într-un model de șobolan hipercolesterolemic indus de HFD. Scopul nostru a fost de a determina modul în care GM răspunde la reducerea nivelului de colesterol indusă de atorvastatină într-un model de șobolan hipercolesterolemic indus de HFD. În special, am căutat să determinăm dacă tratamentul medicamentos poate afecta compoziția GM și diversitatea la șobolanii hipercolesterolemici în comparație cu martorii sănătoși.
Rezultatul
Analiza hipercolesterolemiei și tratamentul medicamentos
Hipercolesterolemia a fost confirmată după 5 săptămâni de hrănire cu HFD cu niveluri crescute de colesterol seric. Nivelurile de colesterol (P 
Abundența relativă exprimată ca procent din filozofia bacteriană dominantă și/sau prezentă frecvent între diferitele grupuri de dietă și medicamente. Punctele limită pentru selectarea filului dominant au fost stabilite la> 1% și taxonii prezenți în mod obișnuit s-au găsit la> 50% dintre șobolanii din grup. NCD, dieta normală; NCD-T, dietă normală + tratament cu atorvastatină; HFD, dietă bogată în grăsimi; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg atorvastatină; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg atorvastatină; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg atorvastatină; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg atorvastatină.
Imagine la dimensiune completă
Modificarea microflorei intestinale ca răspuns la HFD
Modificarea dozei dependente de taxon în grupul cu atorvastatină comparativ cu martorii
Numărul relativ de proteobacterii a fost semnificativ (P
Coordonarea fundamentală multidimensională a analizei compoziției comunităților microbiene între diferite grupuri. PCoA a fost efectuat din secvențe la nivelul OTU cu similaritate> 97% folosind metrica de distanță UniFrac neponderată. NCD, dieta normală; NCD-T, dietă normală + tratament cu atorvastatină; HFD, dietă bogată în grăsimi; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg atorvastatină; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg atorvastatină; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg atorvastatină; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg atorvastatină.
Imagine la dimensiune completă
Sunete de analiză a diversității secvenței alfa. ( A ) Curbele rare ale OTU observate experimental versus ( B ) estimat folosind Chao1. ( C ) Biodiversitatea estimată din indicele Shannon. NCD, dieta normală; NCD-T, dietă normală + tratament cu atorvastatină; HFD, dietă bogată în grăsimi; 5 mg/kg, HFD + 5 mg/kg atorvastatină; 10 mg/kg, HFD + 10 mg/kg atorvastatină; 15 mg/kg, HFD + 15 mg/kg atorvastatină; 20 mg/kg, HFD + 20 mg/kg atorvastatină.
Imagine la dimensiune completă
Ca și în grupurile HFD, abundența relativă a tulpinii Proteobacteria, familiile (Porphyromonadaceae, Desulfovibrionaceae și Helicobacteraceae) și genul Helicobacter au crescut în grupul NCD-T comparativ cu grupul de control NCD. În plus, Clostridiaceae, Lachnospiraceae, Spirochaetaceae și Eubacteriaceae au arătat o creștere semnificativă a grupului NCD-T comparativ cu controlul NCD (Tabelul suplimentar 2). În mod similar, genurile Treponema, Lachnoclostridium, Barnesiella, Ruminococcus, Eubacterium, Desulfovibrio și Roseburia au crescut în grupul NCD-T. În timp ce printre genurile dominante, abundența relativă de Oscillospira, Prevotella, Bacteroides și Parabacteroides a fost redusă în grupul NCD-T comparativ cu controlul NCD (Tabelul suplimentar 3).
Corelații între sex și nivelurile de colesterol
O corelație generală cu nivelurile de colesterol a fost efectuată utilizând analiza de corelație nonparametrică a lui Spearman. S-a constatat că taxonii dominanți care au fost modificați în grupurile NCD-T, HFD, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg și 20 mg/kg se corelează cu diferiți colesteroli. Genele care au fost corelate negativ cu nivelurile LDL (ρ> −0, 17), TG (ρ> −0, 14) și colesterol (ρ> −0, 27) includ Clostridium, Desulfovibrio, Roseburia, Blautia, Helicobacter, Ruminococcus și Lactobacillus (Fig. 5). ). Cu toate acestea, Prevotella, Coprococcus, Prevotella [YRC22], Paraprevotella, Clostridia [SMB53] și Dorea s-au dovedit a fi corelate pozitiv cu LDL (ρ> 0, 2), TG (ρ> 0, 1) și colesterol (ρ> 0) niveluri., 26) (Fig. 5). În mod similar, Oscillospira (ρ> 0, 33) a arătat o corelație pozitivă cu nivelurile HDL (Fig. 5).
În general, abundența relativă redusă de Clostridiaceae, Lactobacillaceae, Rikenellaceae, Peptostreptococcaceae și Lachnospiraceae a apărut la diferite doze de tratament cu atorvastatină în grupul HFD. Wang și colab. raportează niveluri reduse de Clostridiaceae după administrarea tulpinilor bacteriene probiotice (Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus și Bifidobacterium animalis) la șoarecii hrăniți cu HFD 28. În mod similar, administrarea de hidroxipropilmetilceluloză fibroasă nefermentabilă la șoarecii hrăniți cu HFD sau trecerea la o dietă cu conținut scăzut de grăsimi a redus incidența Lachnospiraceae 29. În schimb, s-a observat o incidență crescută a Porphyromonadaceae, Ruminococcaceae și Desulfovibrionaceae în grupurile tratate cu medicamente. Administrarea Lactobacillus paracasei la șoareci apo-E -/- a redus semnificativ nivelul colesterolului și a crescut prevalența Porphyromonadaceae în fecale 30. Șoarecii HFD suplimentați cu capsaicină au avut o incidență crescută a Ruminococcaceae 31. În mod similar, o dietă bogată în grăsimi/colesterol suplimentată cu Lactobacillus reuteri active Lactobacillus reuteri active Lactobacillus reuteri active pentru sărurile biliare crește cantitatea de Desulfovibrionaceae 25 .
Tratamentul cu atorvastatină în grupul HFD a crescut incidența relativă a bacteriilor și a parabacteroidelor. Bacteroides și Parabacteroides au avut abundență maximă la 10 mg/kg și 15 mg/kg. În mod similar, administrarea de lizone la șoareci apoE -/- hrăniți cu HFD a crescut nivelurile de bacteroizi și parabacteroizi, împreună cu scăderea nivelurilor de TG32. Bacteroizii sunt asociați cu metabolismul acidului biliar și favorizează deconjugarea acidului biliar conjugat cu taurină prezent în serul 18, 33. O dietă bogată în colesterol/acid colic a modificat compoziția acidului biliar fecal 34 și acidul biliar modificat a fost asociat cu disbioză 35. Nivelul de Desulfovibrio (bacterii producătoare de endotoxine și bacterii reducătoare de sulfat) 36, 37 a arătat o abundență relativă crescută în grupul NCD-T.
În mod similar, genul Parabacteroides, care conține bacterii antiinflamatorii 38, a arătat o creștere consistentă a abundenței relative la diferite doze de atorvastatină din grupul HFD. Ruminococii (bacterii producătoare de triptamină) 39 au prezentat niveluri suprimate de tratament cu atorvastatină la șobolanii hrăniți cu HFD. Genul Oscillospira, care include specii producătoare de butirat 40, a arătat o creștere consistentă a grupului de HFD tratate cu medicamente. Tratamentul cu rapamicină (un regulator al consumului și stocării de energie) la șobolanii obezi induși de HFD a dus la creșterea nivelului de Turicibacter 41. În studiul nostru, am constatat un nivel redus de Turicibacter în grupurile HFD tratate cu medicamentul. În mod similar, Clostridium (taxoni producători de butirat) 42 a prezentat niveluri reduse în grupul tratat cu medicamente. În conformitate cu constatările noastre, Di Lucci et. al. a raportat o incidență crescută a coprococului în sindromul metabolic bogat în fructoză la un model de șobolan obez 43 .
Catry și colab. au raportat niveluri crescute de specii de Lactobacillus după administrarea de ezetimib și simvastatină la șoarecii hrăniți cu NCD 7. În grupul NCD-T, am observat o incidență relativă crescută a Lactobacillus. Capacitatea bacteriilor care scad colesterolul Lactobacillus a fost demonstrată anterior prin administrarea Lactobacillus reuteri LR6, Lactobacillus reuteri NCIMB 30242 și Lactobacillus johnsonii BS15 la șobolani și pacienți cu hipercolesterolemie și într-un model de șoarece de boală grasă nealcoolică. determină rolul său exact în metabolismul colesterolului. În timpul tratamentului cu atorvastatină, am căutat să corelăm nivelul colesterolului la șobolani cu numărul relativ de bacterii potențiale care scad colesterolul. Limita studiului nostru a fost lipsa datelor metabolomice. Utilizarea acestui instrument ar putea oferi o legătură detaliată între compoziția metaboliților serici și microbiom în raport cu tratamentul cu atorvastatină.
În general, acest studiu a indicat efectul atorvastatinei asupra modelului animal modificat genetic al HFD. În special, administrarea de atorvastatină a crescut diversitatea bacteriană și a returnat un număr relativ de mai mulți taxoni dominanți care au fost modificați de HFD către fenotipul NCD. Tratamentul cu atorvastatină a cauzat, de asemenea, un efect specific al medicamentului asupra distribuției populației anumitor bacterii din grupurile de tratament HFD și NCD-T. Diferite clase de medicamente care scad colesterolul pot provoca efecte diferite asupra microbiolului intestinal și pot oferi o legătură potențială între compoziția GM, nivelurile de colesterol și tratamentul medicamentos. În concluzie, medicamentele care scad colesterolul, care sunt prescrise în mod obișnuit în timpul hipercolesterolemiei, trebuie analizate pentru a modifica efectele microbiomului care pot avea un efect semnificativ asupra sănătății gazdei.
Material și reactivi
Modelul și tratamentul animalelor
Patruzeci și doi de șobolani Wistar fără patogeni (100-120 g) au fost furnizați de Departamentul de Biochimie, Universitatea King Abdulaziz, Jeddah, Arabia Saudită. HFD conținea 3% colesterol (Sigma Aldrich Co., SUA), 0,2% acid colic (Sigma Aldrich Co., SUA), 15% seu de vită și 81,8% furaje normale. Toate ingredientele adăugate au fost luate ca procent din dieta totală. Atorvastatina (Pfizer Inc., SUA) a fost utilizată ca medicament pentru scăderea colesterolului. Toate experimentele pe animale din acest studiu au fost efectuate pe animale din facilitățile Departamentului de Biochimie, Facultatea de Științe, Universitatea King Abdulaziz. Protocolul de studiu a fost aprobat de Comisia de Cercetare Etică a Facultății de Medicină a Universității Regele Abdulaziz sub numărul acordului (numărul de înregistrare HA-02-J-008). Experimentul a fost realizat în conformitate cu liniile directoare aprobate.
Șobolanii au fost aclimatizați la parametrii de mediu standardizați pentru animale timp de 7 zile, inclusiv temperatura (21 ± 1 ° C), umiditatea relativă (60 ± 10%) și un ciclu de 12 ore zi-noapte. Condițiile ambientale pentru animale au fost menținute până la sfârșitul experimentului. Inițial, 42 de șobolani au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri și au fost hrăniți fie cu o dietă normală (NCD; n = 12), fie cu o dietă bogată în grăsimi (HFD; n = 30). Hipercolesterolemia a fost confirmată după 5 săptămâni de tratament cu HFD. Din grupul NCD, șase șobolani au fost tratați cu 10 mg/kg/zi de atorvastatină (NCD-T), în timp ce ceilalți șase șobolani au fost menținuți ca martori NCD. În grupul hipercolesterolemic indus de HFD, șase șobolani au servit drept martori HFD, iar restul de 24 de șobolani au fost împărțiți în patru grupuri egale și tratați cu concentrații diferite de atorvastatină (5, 10, 15 sau 20 mg/kg/zi). Atorvastatina a fost suspendată într-o cantitate calculată de apă distilată sterilă utilizând un agitator magnetic și medicamentul a fost administrat intragastric o dată la 24 de ore folosind Sonda 47. Animalele au fost tratate cu atorvastatină timp de 28 de zile.
Prelevarea de probe de sânge și țesuturi și analiza nivelurilor de colesterol
Probele de sânge au fost prelevate din plexul orbital în două momente: după 5 săptămâni pentru confirmarea hipercolesterolemiei în grupul HFD și înainte de sacrificare pentru a evalua efectul tratamentului medicamentos asupra nivelurilor de colesterol din grupurile de studiu. Serurile au fost izolate din probe de sânge prin centrifugare la 3000 rpm la 4 ° C timp de 15 minute. Profilurile lipidice, inclusiv LDL seric, colesterol, TG și HDL, au fost testate folosind un analizor automat biochimic (Aeroset 09D0501, american). Conținutul de cecal a fost colectat de la toate animalele imediat după sacrificare și depozitat la -80 ° C pentru izolarea ADN-ului.
Secvențierea ARNr 16S și prelucrarea datelor
ADN-ul metagenomic a fost extras din conținutul cecal folosind un kit de extracție ADN AccuVisBio (AccuVisBio, Abu Dhabi) conform instrucțiunilor producătorului, iar concentrația ADN a fost măsurată utilizând un sistem Qubit (Invitrogen, SUA). Probele au fost secvențiate pentru 16 gene de ARNr S, vizând regiunea V3-V4 folosind coduri de bare de primeri universali 341 F și 785 R conform procedurii lui Dowda și colab. 48. Coduri de bare cu index dublu și adaptoare de secvență Illumina au fost utilizate pentru a conecta cititoarele printr-un ciclu PCR limitat. După purificare cu margele Agencourt AMPure (Agencourt, SUA), bibliotecile au fost normalizate utilizând protocolul Nextera XT. Probele au fost reunite într-o singură celulă de flux pentru secvențierea pe o platformă de secvențiere MiSeq (Illumina, San Diego) conform protocolului producătorului. Generarea automatizată de cluster și asocierea secvențială cu indexare duală au fost efectuate într-un singur ciclu cu o lungime de citire de 2 x 300 bp.
Citirile terminale pereche au fost colectate folosind PANDAseq, iar fișierele Raw FASTQ au fost obținute de la Illumina MiSeq 49. Amorsele și codurile de bare au fost eliminate din secvențe. Toți cititorii cu „N” și cei cu secvențe de 50. Secvențele purificate au fost apoi grupate la k = 10 (97% similaritate), urmată de ștergerea himerelor și singletonul citește 51.52. În cele din urmă, OTU-urile au fost clasificate folosind QIIME 1.9 în comparație cu o bază de date curativă derivată din GreenGenes 53. Datele secvențiale din acest studiu sunt disponibile în Arhiva Europeană a Nucleotidelor în cadrul proiectului nr. PRJEB23060.
analize statistice
Biodiversitatea și bogăția OTU au fost calculate utilizând QIIME 1.9 implementat cu analiza Chao1 non-parametrică și analiza de diluare, care au arătat uniformitatea și distribuția OTU în diferite grupuri. Datele au fost normalizate la același număr de citiri pe eșantion și PCoA a fost efectuată din secvențe la nivelul OTU cu similaritate> 97% folosind metrica de distanță UniFrac neponderată. Graficul PCOA a fost vizualizat de EMPEROR. Au fost efectuate teste ANOVA unidirecționale (pentru date parametrice) și non-parametrice Kruskal-Wallis și Mann-Whitney (pentru date non-standard) pentru a identifica taxoni bacterieni semnificativ diferiți între diferite grupuri, în timp ce testul Kolmogorov-Smirnov D a fost folosit pentru determina normalitatea. date. SPSS versiunea 16 a fost utilizată pentru analiza statistică. Diferențele nivelurilor de colesterol dintre grupurile de control și cele tratate au fost analizate prin testul t Student (cu două cozi) folosind GraphPad Prism versiunea 6.01 (Graph Pad Software, San Diego, SUA) și diferențele semnificative au fost desemnate ca * P