Rezumat 1980 Platforma nefrologică, duminică, 5/2
Scăderea excreției urinare de citrat, o cauză importantă a pietrelor la rinichi, apare în CMA sau hipokaliemie (lowK). Studiile de microperfuzie au arătat că principala reglare a citratului urinar este reabsorbția citratului tubular proximal. ATP CL, enzima citosolică responsabilă de scindarea citratului la oxaloacetat și acetil-CoA, joacă un rol important în dezvoltarea hipocitraturiei (J Clin Invest 98: 2381). CMA și lowK cresc activitatea ATP CL și a proteinelor în cortexul renal. Cu toate acestea, segmentul tubular specific în care apare această creștere nu este cunoscut. În plus, s-a demonstrat că administrarea unui inhibitor specific al ATP CL, 4S-hidroxicitrat, crește citratul. Scopul acestor studii a fost identificarea părții rinichiului responsabilă de creșterea observată a proteinei ATP CL corticale renale și examinarea efectului 4S-hidroxicitratului asupra activității și abundenței ATP CL.
Șobolanii masculi, de 180-220 g, au fost plasați în cuști metabolice individuale. Animalele de control au primit apă ad lib și au fost hrănite perechi de șobolani, animalele experimentale au primit apă NH4CI 0,28 M, ad lib. După 7 zile, animalele au fost spălate la 300 torr cu 3% paraformaldehidă și 0,05% acid picric în tampon de cacodilat 0,1 M cu 10% Pentaspan® (DuPont). Secțiunile renale au fost fixate în 10% formalină și tăiate în secțiuni de 3 μ. Etichetarea imunoperoxidazei a fost efectuată utilizând un kit Vectastain® ABC (Vector Laboratories, California). Anticorpul primar anti-șobolan de iepure, utilizat anterior pentru imunoblotare, a fost utilizat la o diluție de 1: 200.
Pentru studii care utilizează un inhibitor ATP CL, șobolanilor li s-au administrat șobolani normali și apă NH4CI, ad lib. După 7 zile, animalelor li s-a administrat 2 mmol/kg/zi prin gavaj cu CitrinK-Mg® (Sabinsa, New Jersey). După 2 zile, animalele au fost sacrificate și perfuzate așa cum s-a descris mai sus. Un rinichi a fost prins și îndepărtat înainte de perfuzie pentru a determina activitatea ATP CL și nivelurile de proteine ca înainte.
Rezultatele imunohistochimiei noastre au arătat că proteina ATP CL este localizată în nefron. Cu toate acestea, la animalele cu CMA, o creștere de 3 ori a colorării a avut loc numai în segmentul proximal al tubulilor, în special la marginea periei. În studiile pe animale care au primit un inhibitor ATP CL, citratul urinar a crescut de cinci ori. Cu toate acestea, nu a existat nicio diferență în activitatea CL ATP (în hidroxamat nmol/mg proteină/30 min; 132 ± 16 vs. 134 ± 14) sau proteina ATP CL prin imunoblotare. În concluzie, inhibarea ATP CL de 4S-hidroxicitrat observată in vivo nu persistă in vitro. Prin imunohistochimie, proteina ATP CL se găsește în tot nefronul. Creșterea imunomarcării tubulare proximale ATP CL observată la șobolanii CMA oferă dovezi suplimentare despre importanța acestei enzime și a acestui segment tubular în dezvoltarea hipocitraturiei.