rapoartele

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Activarea unui program termogen este asociată cu o scădere a GSH
  • Depleția GSH prin tratament BSO afectează selectiv țesutul adipos și induce remodelarea formei sale
  • Tratamentul BSO induce rumenirea celulelor grase și dezlipirea mitocondrială de către Fox01
  • discuţie
  • metode
  • Linii celulare, tratamente și transfecții
  • Șoareci și tratamente
  • Izolarea mitocondriilor
  • Determinarea carbonilării proteinelor
  • Electroforeză pe gel și Western blot
  • Analiza RT-qPCR
  • Determinarea nivelurilor GSH
  • Testul potențialului membranei mitocondriale și absorbția glucozei
  • imunohistochimie
  • Consumul de oxigen
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Istoria schimbărilor
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

Acest articol a fost actualizat

abstract

Țesutul adipos are mai multe funcții metabolice și este implicat în primul rând în reglarea homeostaziei energetice. Nomenclatura tradițională are țesut adipos alb și maro, în funcție de aspectul său macroscopic. Țesutul adipos alb (WAT) este alcătuit din adipocite albe și este considerat, în general, un rezervor de energie al lipidelor neutre. WAT stochează excesul de calorii pentru utilizare în alte țesuturi în timpul deficiențelor de nutrienți. Țesutul adipos maro (BAT) este în primul rând locul termoreglării. BAT este, de fapt, un țesut oxidativ care, atunci când este activat complet, folosește acizi grași depozitați în adipocite maronii pentru a promova activitatea proteinei de detașare 1 (Ucp1 sau termogenină), care împrăștie gradientul protonului mitocondrial pentru a produce căldură.

WAT este capabil să obțină o plasticitate mare și suferă o remodelare continuă în timpul vieții ca răspuns la mulți stimuli de mediu (medicamente, substanțe nutritive etc.) și la condiții fiziologice (de exemplu îmbătrânire, obezitate). Prezența neașteptată a celulelor cu adipocite maro caracteristice a fost observată în WAT 4, 5. Prin urmare, clasificarea adipocitelor a fost recent actualizată. În special, adipocitele brite (alb-maroniu) sau bej sunt denumirea utilizată pentru a distinge celulele maronii localizate în WAT de adipocitele albe și maro 6, 7. Important, cu stimuli fiziologici, cum ar fi exercițiul fizic și expunerea la frig, WAT poate evolua către un fenotip maro 8, 9, 10, 11. În timpul acestui proces (rumenire), expresia genelor BAT clasice este declanșată în WAT, ceea ce crește consumul de energie și duce la pierderea în greutate. Ca rezultat, rumenirea WAT ​​are un efect pozitiv asupra sensibilității la obezitate la adipozitate, rezistență la insulină și hiperlipidemie 2, 12. Cu toate acestea, condițiile patologice, cum ar fi inflamația și cancerul, provoacă, de asemenea, rumenirea WAT ​​13, 14, 15 .

Există, de asemenea, un nou consens că BAT metabolică activă este la om de la nou-născuți la adulți 16 și niveluri mai scăzute de BAT sunt asociate cu obezitatea și diabetul 17, 18. Acest interes reînnoit pentru funcția BAT și efectele recrutării sale asupra metabolismului general al energiei corpului. Creșterea cheltuielilor de energie prin prăjirea WAT ​​sau activarea BAT este, prin urmare, un obiectiv atractiv pentru reducerea riscului de obezitate și a patologiilor conexe 17, 18 .

Calea complexă a expresiei genice controlează dezvoltarea fenotipului adipocit și răspunsul metabolic la intrări specifice. Recent, s-a demonstrat că inducerea genelor care organizează metabolismul și diferențierea celulelor grase este indusă de modificările stării redox intracelulare 19, 20. În plus, potențialul redox pare să moduleze eficiența metabolismului mitocondrial 21. În acest sens, mitocondriile adipocite brune au un nivel mai ridicat de producție a speciilor reactive de oxigen (ROS) și o stare mai oxidată în comparație cu alte tipuri de celule 21. Expunerea la frig mută în continuare mitocondriile redox ale adipocitelor brune într-o stare prooxidativă, iar acest eveniment este necesar pentru buna funcționare a mitocondriilor BAT 21. Aceste observații sugerează o caracteristică BAT foarte specială pentru toate celelalte țesuturi care se bazează pe funcția lor de a avea un mediu mai reductiv 22, 23 .

Glutationul (GSH) este sistemul redox major al disulfurii de tiol în toate tipurile de celule 24, iar modificările concentrației sale sunt recunoscute pe scară largă pentru a promova diferențierea celulară 25. În ultimii ani, s-a demonstrat că multe aspecte ale fiziologiei țesutului adipos depind îndeaproape de sistemul redox al GSH 26, 27, 28. Diferențierea adipocitelor este promovată de condiții care favorizează oxidarea compartimentelor intracelulare 29. În special, variațiile raportului dintre GSH și GSSG la condițiile oxidative însoțesc adipogeneza 28, 30 și epuizarea GSH în timpul diferențierii accelerează maturarea adipocitelor albe și crește acumularea de trigliceride 28. Interesant, toate condițiile care au fost raportate pentru a preveni activarea BAT și/sau rumenirea WAT ​​(de exemplu, exerciții acute, expunere la frig, inflamație și cancer) sunt în sine semne stresante care sunt asociate cu stresul oxidativ și ar putea provoca o schimbare remarcabilă în nivelul redox de GSH. starea condițiilor de prooxidare în plasmă și țesuturi 14, 31, 32. În ciuda acestor dovezi, rolul GSH în modularea activității BAT și rumenirea WAT ​​este complet necunoscut.

În acest raport, am luat în considerare posibilitatea ca reducerea concentrației de GSH să ducă la un proces de rumenire. Am arătat că nivelurile de GSH scad în timpul rumenirii celulelor adipoase și că tratamentul cu inhibitorul non-toxic al sintezei GSH butionine sulfoximine (BSO) induce reglarea în sus a genelor respiratorii nesegregate (de exemplu, Ucp1 și Ppargcla) în maro și alb adipocite. Important, am constatat, de asemenea, că inducerea factorului de transcripție sensibil la redox Fox01 este esențială pentru reacția de rumenire.

Rezultatul

Activarea unui program termogen este asociată cu o scădere a GSH

( A ) Nivelurile de ARNm Ucp1 au fost măsurate prin RT-qPCR în eWAT și BAT la șoareci expuși la frig (4 ° C timp de 20 de ore). Datele sunt raportate ca inducție de pliere în raport cu șoarecii martori (21 ° C) și sunt exprimate ca medie ± SD (n = 3 șoareci per grup; * p

( A ) Conținutul GSH a fost măsurat prin HPLC în eWAT și BAT de la șoareci tratați cu BSO (20 mM în apă potabilă) timp de 5 săptămâni (panoul din stânga). Oxidarea proteinelor a fost determinată prin testarea reziduurilor de carbonil prin analiza Western blot (panoul din dreapta). Actina a fost utilizată ca control de încărcare. Următoarele sunt analize densitometrice ale benzilor imunoreactive normalizate cu actină. Bloturile originale de lungime completă sunt enumerate în Anexa nr. FIG. S3. Datele sunt raportate ca proteine ​​nmol GSH/mg și sunt exprimate ca medie ± SD (n = 4 șoareci per grup, * p

( A ) nivelurile de ARNm de Ppargcla, Ppara, Ucp1, Fgf21, Cidea și Dio2 măsurate în țesutul adipos al șoarecilor tratați cu BSO timp de 24 de ore (20 mM în apă potabilă). Datele sunt raportate ca inducție a pliurilor în raport cu martorul și sunt exprimate ca medie ± SD (n = 4 șoareci per grup; * p 10-4 celule) și sunt exprimate ca medie ± SD (n = 4; * p 3, 40. Interesant, dispozitivul termogen montat la rece la șoareci și izoproterenol în celulele 3T3-L1 a fost, de asemenea, caracterizat prin inducerea Fox01 (Fig. 4A, B). Este de remarcat faptul că reducerea GSH prin tratamentul BSO a reușit să regleze în mod eficient Nivelurile Fox01 atât în ​​adipocitele WAT, cât și în cele 3T3-L1 care imită ceea ce s-a observat în timpul tratamentului.răceală și izoproterenol (Fig. 4C).

( A ) Nivelurile Fox01 au fost detectate de Western blot în eWAT și BAT la șoareci expuși la frig (4 ° C timp de 20 de ore). Următoarele sunt analize densitometrice ale benzilor imunoreactive normalizate cu actină. Bloturile originale originale sunt listate în Anexa nr. FIG. S5. Datele sunt raportate ca o schimbare de ori de la eWAT 21 ° C și sunt exprimate ca medie ± SD (n = 3 șoareci per grup, ** p 8, 9, 10, 11) .În plus, astfel de condiții generează modificări ale homeostaziei redox, ducând la stări de prooxidare 14, 31, 32. Reacțiile pe bază de tiol sunt puternic implicate în controlul multor procese celulare, inclusiv diferențierea celulară 33, 34. .

Fox01 este un factor de transcripție sensibil la redox care modulează ușor metabolismul lipidic în celulele grase 1. Inducerea proteinei Ucp139 este, de asemenea, implicată în rolurile Fox01 în metabolismul țesutului adipos. În consecință, am susținut că expresia genelor legate de maro, cum ar fi Ucp1, este modulată de BSO prin calea FoxO1 în adipocite albe. Într-adevăr, suplimentarea cu ester GSH limitează eficient activarea Fox01 și expresia genei Ucp1.

În general, descoperirile noastre subliniază rolul crucial al sistemului redox GSH în adaptarea metabolică a adipocitelor prin disipare crescută a energiei. Studiile clinice de fază I cu perfuzie continuă de BSO au arătat că GSH poate fi epuizat fără toxicitate nejustificată a țesuturilor 55, 56. Prin urmare, datorită capacității sale de a disipa excesul de energie prin deconectarea mitocondrială în WAT și BAT, BSO poate fi considerat în studiile viitoare ca un medicament cu potențial terapeutic puternic pentru tratamentul bolilor metabolice.

metode

Linii celulare, tratamente și transfecții

Șoareci și tratamente

Toate experimentele la șoarece au fost efectuate în conformitate cu un standard acceptat de îngrijire a animalelor umane și cu acordul comitetelor naționale relevante (Ministerul Îngrijirii) și ale comitetelor locale (Instituțională de îngrijire și utilizare a animalelor, Universitatea Tor Vergata). Șaisprezece șoareci masculi C57BL/6 (1 lună) (cumpărați de la Harlan Laboratories Srl, Urbino, Italia) au fost împărțiți în mod aleatoriu în 2 grupe: șoareci netratați (grup martor, n = 8 șoareci) sau șoareci tratați cu BSO (BSO, n = 8 șoareci). Șoarecii tratați cu BSO au fost împărțiți aleatoriu în două subgrupuri: șoareci tratați timp de 24 de ore (n = 4 șoareci) sau șoareci tratați timp de 5 săptămâni (n = 4 șoareci). BSO a fost furnizat în apă potabilă la o concentrație finală de 20 mM. Șase șoareci masculi C57BL/6 (vârsta de 6 săptămâni) au fost împărțiți în mod aleatoriu în două grupuri: un grup de temperatura camerei (grup de control, 21 ° C) sau un grup rece (4 ° C). Expunerea la rece a fost menținută timp de 20 de ore. Toți șoarecii au fost adăpostiți în cicluri de lumină/întuneric de 12 ore și au avut acces gratuit la alimente și apă. După dislocarea colului uterin, țesuturile au fost explicate și prelucrate imediat.

Izolarea mitocondriilor

Mitocondriile țesutului adipos brut au fost obținute așa cum este descris în Wieckowski și colab. 58. Mitocondriile purificate din 3T3-L1 și T37i au fost obținute în conformitate cu Kristian și colab. 59 cu unele modificări. Pe scurt, celulele au fost lizate la 4 ° C în tampon de omogenizare (210 mM manitol, 70 mM zaharoză, 5 mM HEPES, pH 7,4) suplimentat cu EGTA (Sigma-Aldrich), albumină 0,5% și inhibitori de protează și fosfatază. (Sigma- Aldrich)) și centrifugat la 600 xg timp de 3 minute la 4 ° C pentru a granula miezurile și particulele grele. Supernatantul a fost colectat și centrifugat la 17.000 x g timp de 17 minute la 4 ° C pentru a granula mitocondriile, care au fost apoi spălate de două ori prin centrifugare la 17.000 x g timp de 15 minute la 4 ° C.

Determinarea carbonilării proteinelor

Proteinele carbonilate au fost detectate folosind kitul Oxyblot (Merck Millipore, Darmstadt, Germania) așa cum a fost descris anterior 3. Pe scurt, 15 μg de proteine ​​au reacționat cu 2,4-dinitrofenilhidrazină (DNP) timp de 15 minute la 25 ° C. Probele au fost prelevate pe geluri SDS-poliacrilamidă 10% și proteinele derivate DNP au fost identificate prin Western blot folosind un anti-DNP. anticorp și un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean.

Electroforeză pe gel și Western blot

Mitocondriile brute, peletele celulare, eWAT și BAT au fost lizate în tampon RIPA (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCI, 12 mM acid deoxicolic, 0,5% Nonidet P-40 și inhibitori ai proteazei și fosfatazei). Probele de proteine ​​au fost utilizate pentru SDS-PAGE urmate de Western blot. Membranele de nitroceluloză au fost colorate cu anticorpi anti-β-actină primari, Fox01 (Santa Cruz Biotechnologies), vDAC, Ucp1 (Abcam, Cambridge, Marea Britanie), pHSL, PKA-Ser-substraturi (Cell Signaling Technologies, Danver, MA, SUA), GSH. (Enzo Lifescience, Farmingdale, NY, SUA) și 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) histidină (donată ușor de Prof. Uchida, Școala de Științe Bioagricole, Universitatea Nagoya, Japonia), toate diluate 1: 1000. membrane au fost incubate cu anticorpul secundar conjugat cu peroxidază de hrean adecvat și benzile imunoreactive au fost detectate folosind un sistem de imagistică Fluorchem după colorare cu reactiv de detectare Western Blotting selectat de ECL (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, SUA). Imunobloturile prezentate în figuri sunt reprezentative pentru cel puțin trei experimente care au dat rezultate similare.

Analiza RT-qPCR

ARN-ul total a fost extras folosind TRI Reagent® (Sigma-Aldrich). Trei μg ARN au fost folosiți pentru retranscriere cu M-MLV (Promega, Madison, WI). qPCR a fost efectuat în triplicat folosind primerii qPCR validati (BLAST), Ex TAq qPCR Premix si PCR LightCycler II in timp real (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), asa cum s-a descris anterior 40. Nivelurile de MRNA au fost normalizate la ARNm de actină și nivelurile relative de ARNm au fost determinate prin metoda 2-AAC .

Determinarea nivelurilor GSH

GSH și GSSG intracelulare au fost testate după formarea derivaților S-carboximetil ai tiolilor liberi cu acid iodoacetic, urmată de conversia grupărilor amino libere în derivat 2,4-dinitrofenil prin reacție cu 1-fluor-2,4-dinitrobenzen, așa cum este descris mai sus. 60 .

Testul potențialului membranei mitocondriale și absorbția glucozei

Pentru a evalua celulele potențiale transmembranare mitocondriale, celulele au fost incubate cu Mitotracker Red (Life Technologies Ltd) la o concentrație de 200 nM (30 minute, 37 ° C) înainte de analiza citofluorimetrică. Pentru a măsura absorbția glucozei, celulele au fost incubate cu analogul fluorescent al glucozei 2-NBDG (Life Technologies Ltd) la o concentrație de 100 μM (30 minute, 37 ° C) înainte de analiza citofluorimetrică.

imunohistochimie

Țesuturile adipoase au fost explicate și fixate imediat peste noapte în soluție de formalină (Sigma-Aldrich), spălate cu apă, deshidratate și încorporate în parafină. Țesuturile încorporate în parafină au fost tăiate în secțiuni de 7 μm și colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) sau anticorp Ucpl. Imaginile prezentate sunt reprezentative pentru un experiment din patru care a dat rezultate similare. Dimensiunea și numărul adipocitelor pe suprafață au fost calculate folosind ImageJ (Adipocytes Tool).

Consumul de oxigen

Consumul de oxigen a fost determinat în adipocite 3T3-L1 albe și T37i maronii utilizând un sistem de electrod de oxigen Oxygraph Plus (Hansatech Instruments Ltd, Norfolk, Marea Britanie). La sfârșitul diferențierii, celulele au fost tratate cu BSO timp de 24 de ore, colectate și resuspendate cu mediu de cultură complet într-o cameră oxigrafică. Consumul de oxigen în timp real a fost înregistrat la 28 ° C timp de 5 minute.

analize statistice

Rezultatele sunt prezentate ca medie ± SD Evaluarea statistică a fost efectuată de ANOVA urmată de Student-Newman-Keuls. Diferențele au fost considerate semnificative pentru P