inserția

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Determinarea structurală a porilor lizeninici
  • Arhitectura asamblării lizeninei
  • Structura cilindrului P
  • Interacțiunea cu lipidele
  • Trecerea la starea introdusă în membrană
  • discuţie
  • metode
  • Producerea și purificarea proteinelor recombinante
  • Test de hemoliză
  • Ansamblul porilor de lizenină
  • Pregătirea probelor și colectarea datelor
  • Procesarea imaginii
  • Crearea și îmbunătățirea modelelor
  • Pregătirea suportului specimenului de oxid de grafen
  • trepte
  • Banca de date cu microscopie electronică
  • Banca de date cu proteine
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Imagini suplimentare
  • Videoclipuri
  • Film complementar 1
  • Comentarii

obiecte

  • Tomografia cu crioelectron
  • Ansamblu supramolecular

abstract

Lizenina din fluidul celomic al râmei Eisenia fetida aparține familiei aerolizinei de toxine mici care formează β-pori (β-PFT), dintre care unele sunt patogene pentru oameni și animale. În ciuda eforturilor, structura acestui grup de proteine ​​de înaltă rezoluție a fost evazivă și, prin urmare, mecanismul de activare și inserare în membrană rămâne neclar. Aici determinăm structura porilor lizininei folosind EMO cristalină cu o particulă cu o rezoluție de 3,1 Å. Ansamblul de măsurare dezvăluie un canal lung cu cilindru ß care se extinde dincolo de lungimea complexului și care conține în mod neașteptat două fibre înainte de inserarea căptușind o buclă de inserție a membranei ipotetică. Examinarea altor membri ai familiei de aerolizine relevă o conservare structurală ridicată în această zonă, sugerând că calea de livrare a membranei în această familie este menținută. Pentru unele toxine, activarea proteolitică și îndepărtarea peptidei vor facilita dezvoltarea fibrelor pre-inserate, permițându-le să formeze un butoi β al canalului.

Lizenina, proteina de apărare a fătului de viermi de pământ Eisenia, este produsă în teemocite din fluidele corporale care fac parte din sistemul imunitar al Pământului 1. Este un membru al familiei de aerosoli cu toxine mici care formează β-pori (β-PFT), care conțin factori cheie de virulență ai unui număr mare de agenți patogeni bacterieni, cum ar fi aerolizina produsă de Aeromonas spp 2, Clostridium perfringens toxina epsilon 3 și Clostridium septicum α-toxina 4, în timp ce Bacillus thuringiensis parasporin-2 are activitate citocidă împotriva celulelor canceroase umane 5. În ciuda omologiei secvenței reduse a structurii, formele lor monomerice solubile în apă dezvăluie că toate au un domeniu conservat structural numit modul de formare a porilor (PFM), despre care se știe că contribuie la porii celor 6 cilindri.

La fel ca majoritatea PFT, lizenina este secretată ca un monomer inactiv, solubil în apă 7. După legarea la sfingomielină (SM) în membrana celulei eucariote, toxina suferă modificări semnificative în structura sa secundară 8 și formează pori oligomerici pe suprafața membranei, așa cum este determinat de cristalografia electronică 9 și studiile de microscopie a forței atomice de mare viteză 10, 11, anterior pentru a fi introdus în membrană pentru formarea porilor și liza celulară ulterioară 12, 13 .

Structura cristalină a lizeninei monomerice a dezvăluit că toxina este organizată în două domenii structurale majore: (1) un PFM alungit la capătul N-terminal care conține un situs de legare SM, precum și o buclă de inserție a membranei care a fost considerată de mult timp a fi o regiune; care se reorganizează într-un ac de păr β în timpul inserției membranei și (2) domeniul beta-trefol C-terminal care s-a cristalizat legat de fosfocolină (POC) 9. Examinarea structurii lizeninei monomerice legate de SM a arătat că atât legătura principală POC, cât și un capăt al lanțului acil SM sunt necesare pentru legarea toxinei.

Deși în trecut au fost identificate mai multe structuri pentru formele monomerice ale toxinelor din familia aerolizinelor 2, 3, 5, 9, 14, 15, 16, 17, 18, nu este dată nicio structură atomică pentru formele lor de pori activi. Aici prezentăm structura lizeninei în forma sa crio-EM încorporată în membrană non-americană cu particule unice cu o rezoluție de 3,1 Å. Structura oferă o primă privire asupra rezoluției atomice a unui membru inserat de membrană din familia aerolizinei și oferă informații despre modul în care ceilalți membri ai acestei familii pot fi activați și asamblați în formele lor de pori respectivi.

Rezultatul

Determinarea structurală a porilor de lizenină

Reprezentarea suprafeței unei hărți ascuțite de 3, 1 Å a lizeninei prezentată lateral ( A ) și vederi extracelulare ( b ). Densitățile lanțului lateral sunt clar vizibile pe porii cilindrului ß. Sunt raportate trei domenii ale subunității lizeninei: β-ac de păr (măslin), capac (roz) și domeniu de legare a receptorilor (cian). O micrografie crioelectronică reprezentativă a complexelor de lisenină pe oxid de grafen ( c ) obținut la o estompare de -2,3 μm pe un FEI Titan Krios cu un detector Gatan K2 Summit. Medii caracteristice ale clasei 2D de oligomer de lizenină ( d ). Scală, 20 nm.

Imagine la dimensiune completă

Arhitectura asamblării lizeninei

Ilustrație cu desene animate a lizinei afișată din lateral ( A ) și vederi extracelulare ( b ). Cele trei domenii de lisenină sunt colorate ca în Figura 1: β-ac de păr (măslin), capac (roz) și domeniu de legare a receptorului (cian). Dimensiunile complexului și ale porilor sunt prezentate ca măsurători Cα-Cα, iar locația aproximativă a stratului bicomponent este reprezentată grafic cu grupele capului fosfolipidic prezentate în portocaliu și miezul hidrofob în gri. Inelele aromatice Phe70 și Tyr79 sunt listate în bară, la fel și resturile de histidină direct deasupra inelului Tyr79. Reziduurile site-urilor de legare la fosfocolină (POC) sunt prezentate ca sfere și un asterisc indică o bobină flexibilă care leagă domeniul de legare a receptorului de domeniul capac. ( c ) Reprezentarea suprafeței unui strat de detergent filtrat Gauss (purpuriu) în jurul unei hărți ascuțite a liseninei. d ) O privire atentă asupra părții extracelulare a centurii de detergent, care evidențiază cele trei reziduuri de histidină.

Imagine la dimensiune completă

Structura cilindrului P

Interacțiunea cu lipidele

Lizenina monomerică s-a cristalizat anterior legată de liganzii SM și POC 9, deși aceste structuri erau în mod clar într-o stare solubilă în apă. POC a fost cristalizat legat de domeniul C-terminal β-trefoil al lizeninei într-un buzunar flancat de Lys185, Ser227, Gln229, Tyr233 și Tyr282 (ref. 9). Sub forma porilor de lisenină, acest buzunar este situat ideal pentru interacțiunea cu grupările de cap fosfatidilcolină sau SM, deoarece se află la vârful domeniului de legare a receptorului direct deasupra membranei celulei țintă (Figura 2a, "POC"). SM a fost identificat legat de PFM N-terminal și reziduurile care au interacționat cu SM în structura monomerică (Lys21, Tyr24, Tyr26, Gln117 și Glu128) sunt îngropate în domeniul porilor de lizenină (Figura suplimentară 4d). În plus, nu am găsit densități suplimentare lipidice corespunzătoare în harta C9 simetrizată sau în reconstrucția asimetrică a lizeninei 4, 2 Å. Este posibil ca recunoașterea SM la acest loc să apară înainte de oligomerizare și inserție în membrană, așa cum sa sugerat deja 9. Este, de asemenea, posibil ca concentrațiile mari de detergent utilizate pentru extragerea eficientă a porilor din lipozomi să poată disocia orice molecule lipidice legate de locul de legare alternativ SM din porul lizininei.

Trecerea la starea introdusă în membrană

Figura 3 și filmul suplimentar 1 prezintă dispunerea structurală dintre structura monomerică solubilă (Figura 3a) și starea sa oligomerică încorporată în membrană (Figura 3b). Bobina elastică suspendată între Val157 și Arg159 (Fig. 3a, b, sfere) transformă capacul N-terminal al domeniului în jos cu

20 Å (Fig. 3c) și se rotește spre interior spre lumenul mediu cu 35 ° (Fig. 3d). Prăbușirea verticală este în concordanță cu observațiile AFM ale lizeninei pe straturile biliare plane, care au constatat o scădere a înălțimii de până la 3 nm atunci când sunt introduse în membrană 10. Această mișcare induce o îndoire în mijlocul domeniului relativ plat al monomerului solubil (Fig. 3b, linii punctate) și are ca rezultat situarea fiecărui domeniu al capacului în partea superioară a domeniului subunității de legare a domeniului receptorului adiacent (Film suplimentar 1). Agrafele β necesită conversia completă a 5 β-catene și 3 10 PFM monomer lisină-helix 9 la 2 noi β-catene, așa cum este evidențiat în Figura 3a, b. Acul β începe de lângă partea extracelulară a lumenului porilor și curba către partea intracelulară cu aproape 270 ° (Fig. 3d). Astfel, porii lizeninei dintr-un cilindru B sunt alcătuite din trei ori mai multă polipeptidă decât se credea inițial (24 reziduuri) 9 .

A ) Reprezentarea în desene animate a monomerului de lizenină (PDB ID 3ZXD) și a stării sale inserate de membrană ( b ) cu ambele molecule aliniate în raport cu domeniul de legare a receptorului în orientarea indicată (inserată). Linii punctate vb indicați îndoirea în domeniul capacului și resturile balamalei (Val157 - Arg159) sunt prezentate ca sfere. Schema de culori este prezentată în FIG. 2a cu N-și C-terminale marcate. Reprezentarea monomerului solubil în apă suprapus rigidizat (cian) și forma sa încorporată în membrană (măslin) în raport cu domeniul de legare a receptorilor, așa cum se vede din lateral ( c ) și vizualizarea extracelulară ( d ). Asteriscurile indică Ser31 în ambele structuri. Sunt prezentate o scădere de 20 Å în înălțime și o rotație de 35 ° spre lumenul domeniului capacului.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Structura crio-EM de 315 kDa a porilor de lisenină la rezoluția de 3,1 Å reprezintă prima structură a porilor de rezoluție atomică pentru un membru al familiei mici de β-PFT de aerosoli, dezvăluind tranziția unui monomer solubil în apă la suprafața sa încorporată în membrană, o stare oligomerică. Structura oferă un cadru pentru studii viitoare cu privire la modul în care ceilalți membri ai acestei familii pot realiza formarea porilor și deschide calea pentru proiectarea de noi terapii care vizează perturbarea funcțională a formării porilor pentru această familie.

Comparația structurii monomerice solubile în apă a lizeninei cu alți trei membri ai familiei aerolizinei. Regiunile supuse care contribuie la 3-cilindri în aerolizină (1PRE), toxina epsilon (3ZJX) și parasporină-2 (2ZTB) sunt colorate în verde pentru buclele de membrană contemplate anterior și galbene pentru pre-fibrele de sertizare identificate aici. studiu. Luate împreună, aceste regiuni formează cilindrul β al porului de lizenină. Cele două fibre înainte de introducere sunt de obicei situate la marginea toxinelor și sunt izolate de corpul principal (gri). În cazul aerolizinei și al toxinei epsilon, fibrele de pre-inserție participă la foile β cu CTP (roșu), stabilizând astfel starea monomerică solubilă. În parasporin-2, peptida N-terminală, care nu a fost prezentă în structura cristalină a toxinei activate, a avut cel mai mare efect asupra activității toxinei și s-a crezut că interacționează cu bucla de inserție, acționând astfel ca un blocaj de siguranță .,

Imagine la dimensiune completă

Metoda de inserție a membranei lizeninei identificată în acest studiu este similară cu cea a familiei α-hemolizinei βPFT-urilor mici. Hemolizinele stafilococice și toxina clostridiană NetB suferă o extensie simplă a regiunii din fața tulpinii, care este inserată împotriva domeniului β-sandwich, pentru a forma porii β-cilindri fără modificări semnificative în restul structurii 23, 25, 26 35. Acest mecanism este remarcabil conservat în cadrul acestei familii chiar și atunci când simetria, stoichiometria subunității și regiunile de legare a receptorilor diferă 27. Într-o manieră similară, fibrele pre-inserate de lizenină sunt desfăcute din PFM și dispuse într-un cilindru β lung. Cu toate acestea, spre deosebire de α-hemolizină, PFM al lizeninei suferă o schimbare conformațională care are ca rezultat prăbușirea

20 Á și compactare internă (film suplimentar 1). Modelul porilor pentru aerolizină propus de Degiacomi și colab. Și PFM (domeniile 3 și 4) sunt localizate similar cu lizenina. Cu toate acestea, alungirea acelor de păr pentru aerolizină β poate începe, ca în cazul lizeninei, în partea superioară a PFM și poate include fibre de pre-inserție. Când structurile mai poroase ale familiei de aerolizine sunt rezolvate la rezoluție ridicată, va fi mai clar cum se modifică aceste toxine și în ce măsură sunt păstrate mecanismele de inserție.

Pe baza constatărilor noastre și a lucrărilor anterioare din domeniu, modelul de formare a porilor de lizenină prezentat în FIG. 5. Legarea inițială a monomerilor solubili de membrană va fi mediată prin domeniul de legare a receptorului de grupurile majore POC (Fig. 5a) (referință la 9 și acest studiu). În plus, ajută la orientarea toxinei înainte de formarea porilor. Recunoașterea SM poate apărea și în acest moment. Aceasta va fi urmată de oligomerizare la starea pre-porilor (Fig. 5b), identificată prin AFM 10, 36 și cristalografia electronică 9, prin interacțiuni monomer-monomer, care pot declanșa dezvoltarea firelor β până la o stare de energie mai mică . și permite ambalarea mai apropiată a monomerilor. Oligomerizarea, o etapă care este obligatorie înainte de formarea porilor pentru toate p-PFT-urile caracterizate până acum, asigură prezența unui număr suficient de agrafe β pentru a forma canalele 9 și satisface un mediu hidrofob, cum ar fi o legătură de hidrogen pentru fibra β, de exemplu ca strat strat lipidic 37. În cele din urmă, formarea unui cilindru β formează porii în stratul bistrat (Fig. 5c), ceea ce duce la întreruperea homeostaziei membranei și în cele din urmă la liza celulară.

( A ) Monomerii lizeninici (PDB ID 3ZXD) se vor lega inițial de membrana celulară țintă prin interacțiuni între domeniul de legare a receptorului și porțiunile majore POC. ( b ) La legarea de membrană, creșterea concentrației locale de monomeri va favoriza oligomerizarea, ducând la asamblarea pre-porilor. În funcție de orientarea monomerilor, înălțimea pre-pori poate fi de până la 100 Å (lungime monomer lizenină). ( c ) Forma de lizenină încărcată cu membrană rezolvată în acest studiu se extinde cu 65 Å deasupra suprafeței membranei. Ipoteticul pre-por prezentat aici a fost construit prin încorporarea simetriei de nouă ori într-o structură cristalină monomerică aranjată prin referire la un domeniu de legare a receptorilor într-o formă încorporată într-o membrană.

Imagine la dimensiune completă

metode

Producerea și purificarea proteinelor recombinante

Test de hemoliză

Ansamblul porilor de lizenină

Pregătirea probelor și colectarea datelor

Probele au fost scufundate în congelare folosind un piston fabricat în mod convențional la 4 ° C. Oligomerii de lizenină (3 μl 0,2 mg ml -1) au fost placate pe cupru cu rețea cu grilă rotundă Quantifoil R1.2/1,3 (Quantifoil Micro Tools, GmbH) cu un strat din plasă pătrată (Quantifoil Micro Tools, GmbH) acoperită cu oxid de grafen (vezi mai jos) și lăsată să adere timp de 30 de secunde. Grilele au fost apoi șterse din probă timp de 10 secunde și apoi imersate în etan lichid. Probele au fost realizate pe un microscop electronic cu transmisie FEI Titan Krios care funcționează la o tensiune de accelerare de 300 kV. Micrografiile au fost înregistrate în modul de înaltă rezoluție utilizând un detector de electroni direct Gatan K2 Summit la sfârșitul unui filtru de energie cuantică Gatan în modul de pierdere zero și lățime a fantei cu o selecție de energie de 20 eV. Doza totală din eșantion a fost de 47 e - la Å2 fracționată pe 20 de imagini cu dimensiunea calibrată a pixelilor de 0,715 Å pentru micrografii de înaltă rezoluție.

Procesarea imaginii

Crearea și îmbunătățirea modelelor

Structura cristalină de lizenină de tip sălbatic 9 (PDB ID 3ZXD) a fost utilizată ca șablon pentru modelarea de novo a capătului N după resturile C-terminale 150, care formează domeniul de legare a receptorului β-trefoil. Toate modelele au fost realizate în Coot 45. Modelului îi lipsesc reziduurile terminale 9N, pentru care nu am putut vedea densitatea. Rafinarea modelului pentru îmbunătățirea potrivirii, geometriei și ciocnirilor atomice a fost efectuată folosind REFMAC 5.8 (ref. 46) cu constrângeri de simetrie necristalografice pentru a explica simetria de nouă ori și restricțiile structurii secundare generate de PROSMART 47. Validarea încrucișată a parametrilor de rafinare utilizată pentru a evita supraadaptarea a fost efectuată prin rafinarea modelului în raport cu prima jumătate de hartă nefiltrată și compararea FSC a aceluiași model cu ambele jumătăți de hărți (Fig. Suplimentară 4b).

Pregătirea suportului specimenului de oxid de grafen

Dispersia de oxid de grafen în H20 (Sigma) a fost diluată la 0,2 mg ml -1 în H20 și rotită la 300 g timp de 30 s pentru a îndepărta agregatele mari. Grile cu găuri Quantifoil R1.2/1,3 au fost descărcate strălucitoare timp de 1 min și 3 pl din suspensia de grafen au fost adăugate la rețele timp de 1 min. Grilele au fost recent șterse pe scurt utilizând hârtie de filtru Whatman No1 și spălate de trei ori pe picături de 20 μl de H20 (de două ori pe partea grafenului și o dată pe revers). Grilele au fost apoi utilizate pentru înghețarea prin scufundare fără tratament suplimentar.