keratinocitelor

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Generarea de șoareci cu deficit de A20 specifici epidermei
  • Șoarecii A20 EKO prezintă hiperplazie keratinocitară
  • Șoarecii A20 EKO prezintă anomalii ale suplimentelor ectodermice
  • A20 acționează ca un regulator al căii EDA pentru a activa NF-κB
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară 1
  • Documente Word
  • Imagine suplimentară 1 Legendă
  • glosar

obiecte

abstract

Principalul

Epiderma este formată în principal din keratinocite dispuse în diferite straturi. Keratinocitele bazale sunt active din punct de vedere mitotic și furnizează noi celule care se diferențiază treptat spre suprafața pielii, unde porumb și sunt despicate. Acest proces biologic bine organizat este strict controlat, iar întreruperea secvenței de evenimente poate duce la o varietate de tulburări ale pielii, inclusiv inflamație și cancer. Controlul exact al factorului de transcriere a factorului nuclear KB (NF-kB) este esențial pentru menținerea homeostaziei pielii, dovadă fiind faptul că activitatea excesivă de NF-kB B, precum și ablația activatorilor esențiali de NF-kB B duc la inflamația pielii 1, 2, 3 NF-kB aparține unei familii de proteine ​​legate în mod structural și conservate evolutiv (p100 sau NF-kB B2, p105 sau NF-kB B1, p65 sau RelA, RelB, c-Rel) care există ca homo- sau heterodimeri. În celulele în repaus, NF-κB este menținut inactiv prin legarea la proteinele inhibitoare KB (IBB), dintre care IκBa este cel mai studiat. Numeroși stimuli duc la fosforilarea și polubiquitinarea proteinelor IκB, care le vizează degradarea proteazomală. Acest lucru duce la eliberarea NF-κB, care se acumulează în nucleu și activează transcripțional genele țintă.

Un eveniment central în semnalizarea NF-κB este activarea complexului kinazei IκB (IKK), care constă din două kinaze, IKK1 și IKK2 (cunoscute și sub numele de IKK α și IKK β), și o proteină de reglare a platformei, NF-κ Modulator esențial B (NEMO, cunoscut și sub numele de IKK γ). Experimentele direcționate către gene au arătat că IKK2 și NEMO, dar nu IKK1, sunt necesare pentru activarea NF-kB B prin factorul de necroză tumorală (TNF) și receptorii de tip Toll. 3 Unii receptori, cum ar fi receptorii limfotoxinei β și CD40, pot activa o cale alternativă NF-κB care implică IKK1 și are ca rezultat procesarea p100 NF-κB în p52, care formează un dimer transcripțional activ cu RelB.

Deoarece NF-κB este crucial în dezvoltare și inflamație, este necesară o reglementare strictă a activării sale. Acest control strict se realizează prin acțiunea combinată a regulatorilor pozitivi și negativi. În ultimii ani, ubiquitinarea și dezubiquitinarea (DUB) a mai multor componente de semnalizare NF-κB au fost identificate ca pași esențiali în controlul căilor de semnalizare NF-κB. O frână critică asupra activării NF-κB este enzima ubiquitin A20, care a fost caracterizată ca un inhibitor al activării NF-κB și al apoptozei. A20 este necesar pentru a termina semnalizarea NF-κB ca răspuns la TNF și la produsele microbiene, cum ar fi lipopolizaharida și muramil dipeptida. Importanța activităților anti-inflamatorii in vivo ale A20 este ilustrată de inflamația severă a mai multor organe și de moartea perinatală observată la șoarecii A20 -/-. 24 Studii genetice recente demonstrează o asociere între gena genei proteinei 3 indusă de factorul uman A20/α (TNFAIP3) și patologia autoimună și psoriazisul, sugerând că A20 poate juca un rol important în bolile autoimune și inflamatorii umane. Aceste descoperiri evidențiază importanța A20 în controlul homeostaziei țesuturilor normale și o identifică ca o țintă potențială în tratamentul multor patologii inflamatorii, inclusiv psoriazisul.

Am folosit K14-driven Cre/LoxP-mediate gene gene targeting la șoareci pentru a investiga funcția in vivo a A20 în dezvoltarea epidermică și homeostazie. Arătăm că A20 este esențial pentru controlul proliferării keratinocitelor și pentru dezvoltarea corectă a etichetelor ectodermice. Datele noastre sugerează că o ștergere A20 specifică keratinocitelor duce la supraexprimarea indusă de EDA-A1 a NF-κB, ducând la un șoarece EDA-A1 transgenic fenoscopic.

Rezultatul

Generarea de șoareci cu deficit de A20 specifici epidermei

Pentru a identifica funcțiile A20 specifice țesutului, am generat șoareci care poartă alela condițională A20 în care exonii IV și V ai genei murine A20 sunt flancați de situsuri LoxP. 26 Pentru a studia funcția A20 în suplimentele dermice și epidermice, am încrucișat șoareci A20 FL/FL cu o linie de șoarece transgenică care exprimă Cre sub controlul promotorului genei keratinei 14 umane (K14-Cre). 27 Șoareci epidermici specifici keratinocitelor A20-knockout (A20 EKO) s-au născut cu segregare mendeliană normală (datele nu sunt prezentate). Pentru a verifica ștergerea specifică keratinocitelor A20 la șoarecii A20 EKO (Figura 1a), am confirmat prin analiza Southern blot că recombinarea mediată de Cre a fost eficientă în epidermă și keratinocite primare (Figura 1b). Ca rezultat, nu am putut detecta A20 endogen în extracte epidermice de la șoareci E20 EKO (Figura 1c).

Generarea șoarecilor A20 ECO. A ) Fotografia mouse-ului A20 EKO și a mouse-ului de control A20 FL/FL. ( b ) Analiza Southern blot a ADN-ului de la epidermă și dermă de la șoareci A20 EKO și ADN de la keratinocite izolate A20 FL/FL (WT) și A20 EKO șoareci. ( c ) Extractele de proteine ​​ale țesutului epidermic derivate din eliminări specifice keratinocitelor (A20 EKO) au fost analizate prin Western Blot cu un anticorp specific A20. Banda de proteine ​​A20 este indicată de o săgeată, un asterisc (*) indică benzi nespecifice

Imagine la dimensiune completă

Șoarecii A20 EKO prezintă hiperplazie keratinocitară

Nu au fost observate semne macroscopice de inflamație a pielii, cum ar fi roșeață, descuamare sau zgârieturi excesive din cauza mâncărimii, la șoarecii A20 EKO (Figura 1a). Analiza histologică a secțiunilor dorsale ale pielii a arătat o epidermă îmbunătățită datorită proliferării crescute (de 2,5 ori) a celulelor bazale (Figura 2), dar niveluri foarte scăzute similare de apoptoză (datele nu sunt prezentate). Modelele de expresie ale markerilor de diferențiere caspază-14, filaggrină și keratină 10 au fost normale și celulele imune infiltrante nu au fost observate (datele nu sunt prezentate). Aceste date sugerează că absența A20 nu duce la inflamația spontană a pielii sau că alte enzime DUB, cum ar fi cilindromatoza (CYLD), 28 acționează excesiv pentru a preveni inflamația spontană.

A20 EKO prezintă hiperproliferare ușoară a keratinocitelor. ( A ) Porțiuni din pielea dorsală a șoarecilor A20 FL/FL și A20 EKO au fost colorate cu hematoxilină și eozină și analizate prin microscopie ușoară (scară: 100 μm). ( b ) Colorarea Ki-67-pozitivă (nuclei maro închis) a secțiunilor dorsale ale pielii de la șoareci A20 FL/FL și A20 EKO (coloană de scară: 100 μm). ( c ) Cuantificarea procentului de keratinocite ki-67-pozitive ale stratului bazal în părți ale pielii dorsale a șoarecilor A20 FL/FL și A20 EKO.

Imagine la dimensiune completă

Șoarecii A20 EKO prezintă anomalii ale suplimentelor ectodermice

Plicul șoarecilor A20 EKO a fost dezorganizat (Figurile 1a și 3a). Acest fenotip dezordonat nu a fost niciodată observat în godeurile de control A20 FL/FL. Șoarecii au fost monitorizați până la vârsta de 12 luni și nu au prezentat dovezi ale căderii părului sau alopeciei. Șoarecii A20 FL/FL au trecut de asemenea la linia transgenică K5-Cre, 29 cu care s-a observat un fenotip similar (datele nu sunt prezentate). Toate celelalte experimente au fost efectuate pe șoareci A20 FL/FL/K14-Cre. 27

Șoarecii A20 EKO au părul mai subțire, cu cuticula deteriorată. A ) Imaginea hainei de blană a șoarecilor AKO FL/FL și A20 EKO. ( b ) Părul din spatele șoarecilor A20 FL/FL și A20 EKO a fost epilat. Examinarea microscopică arată prezența părului de gardă, a părului de blană, a părului strâmb și a părului auchen la șoarecii de control A20 FL/FL. Șoarecii A20 EKO au doar părul drept sau creț. ah, păr slab; au, auchen hair; gh, parul de paza; zz, blană strâmbă. ( c A d ) Imagine SEM a părului de la șoareci A20 FL/FL și A20 EKO (coloană de scară: 10 μm). ( e A f ) Secțiuni TEM prin pielea din spate a șoarecilor A20 FL/FL și A20 EKO care prezintă detaliile secțiunii foliculului de păr (scara scării: 500 nm). Șoarecii A20 EKO au un strat de piele hiperplazic și dezorganizat. h, fir de păr; c, strat cuticular

Imagine la dimensiune completă

Alte caracteristici ale fenotipului A20 EKO care fenotipează transgenele EDA. A ) O imagine a labelor observate la microscop binocular arată că șoarecii A20 EKO au unghii mai lungi decât așternuturile de control. ( b ) Analiza macroscopică a cozii arată mai multe fire de păr ondulate și pliuri mai mari asemănătoare șoarecilor A20 EKO. ( c ) Sebocitele din secțiunile cutanate de la șoarecii A20 EKO și șoareci martor au fost colorate cu anticorp anti-adipofilină. (Scală: 500 μm.) ( D ) Suprafețele suprafețelor secțiunilor prin glanda sebacee au fost determinate pe baza acestei colorări folosind software-ul de analiză a imaginii Volocity și au fost comparate suprafețele medii la șoareci de control A20 EKO și șoareci.

Imagine la dimensiune completă

A20 acționează ca un regulator al căii EDA pentru a activa NF-κB

Deoarece pierderea de A20 în piele duce la o fenoscopie parțială a șoarecilor care supraexprimă EDA-A1 cu epiderma, am emis ipoteza că A20 poate fi un regulator negativ al căii EDA. Într-adevăr, folosind un reporter luciferază dependent de NF-κB (Luc), am demonstrat că A20 blochează activarea NF-κB indusă de EDAR în celulele HEK293T într-o măsură similară cu activarea NF-κB B indusă de TNF (Figura). 5a). Folosind mutanți de ștergere, am putut demonstra că activarea NF-κB indusă de EDAR a fost inhibată de domeniul C20-terminal al A20, conținând degetele Zn, dar nu domeniul NUB terminal (Figura 5b și figura suplimentară). 1), indicând faptul că activitatea DUB nu este necesară pentru a inhiba activarea NF-κB. Pentru a verifica acest lucru, am testat și un mutant în două puncte (A20 D100A/C103A) căruia îi lipsește activitatea DUB 32 (Figura 5c și Figura 1 suplimentară). A20 D100A/C103A a fost la fel de eficient ca A20 de tip sălbatic în inhibarea EDF indus de NF-κB, confirmând că activitatea A20 DUB nu este necesară pentru acest efect.

Stimularea EDA-A1 induce expresia A20 în timpul dezvoltării plăcii părului. A ) Expresia A20 a fost vizualizată prin hibridizare in situ pe embrioni cu deficit de EDA și pe WT E14, o culoare albastru închis care indică un semnal pozitiv in situ. Panoul din dreapta arată o decupare vibrantă cu o placă de păr (săgeată). ( b ) Toată hibridizarea in situ a fost efectuată pe embrioni E12 folosind o sondă anti-sens pentru A20 (panourile din stânga) sau Wnt10b (panourile din dreapta) ca un control pozitiv pentru exprimarea în placa dentară (panourile superioare) și mugurul mamar (panourile inferioare) . F, picioarele anterioare; H, membrul posterior; Eu, tăietor placod; m, muguri de sân; M, cod molar; T, limbă

Imagine la dimensiune completă

discuţie

La fel ca IkBα, A20 este un important regulator negativ al semnalizării și inflamației NF-κB. 25 Cu toate acestea, modurile lor de acțiune sunt complet diferite. Funcțiile IkBa se leagă direct de NF-κB și se separă de nucleu, în timp ce A20 este o enzimă de editare a ubiquitinei care inactivează mai multe ținte în calea NF-κB. IKBa este întotdeauna prezent în celulele nestimulate pentru a limita activarea necontrolată a NF-kB B în absența unui declanșator inflamator specific. În contrast, în majoritatea celulelor nestimulate, expresia A20 este slabă, dar este puternic indusă la activarea semnalizării NF-κB. Deoarece expresia IkBa este indusă în continuare la declanșarea NF-κB, atât IkBa, cât și A20 sunt implicate în bucla de feedback negativ a activării NF-κB. Hiperinflamarea la șoareci nuli IkBα sau A20 complet și moartea prematură a acestora indică funcții critice ale IkBa și A20 în reglarea NF-κB. 24, 35, 36, 37

Semnalizarea excesivă a NF-κB în piele, cum ar fi keratinocitele specifice șoarecilor knockout IκB α și șoarecii transgenici K5-IKK2, induce dermatită. 37, 38 În mod neașteptat, deși șoarecii A20 EKO au dezvoltat hiperproliferare epidermică, aceștia nu au dezvoltat inflamație spontană. Prezența IKBa funcțională poate fi suficientă pentru a controla răspunsurile inflamatorii minore împotriva insultelor de mediu. Alternativ, enzimele DUB redundante care controlează activarea NF-κB, cum ar fi CYLD, pot fi active în piele. Deși CYLD este marcat în epidermă, șoarecii CYLD -/- nu prezintă anomalii ale pielii. 28 Ablația A20 și CYLD poate fi necesară în cazul dermatitei spontane severe.

Arătăm că o ștergere specifică epidermică a A20 duce la multiple anomalii în organele ectodermice, similar cu supraactivarea căii EDA. 18, 19, 20, 21, 22, 39 Similitudinea șoarecilor A20 EKO cu șoarecii care supraexprimă EDA-A1 sau EDAR și inhibarea semnalizării EDAR de către A20 in vitro sugerează cu tărie că hiperactivarea căii EDA este cauza principală a A20. Fenotip ECO. Această concluzie este susținută în continuare de constatarea noastră că EDA-A1 induce expresia A20 și că ARNm A20 co-localizează cu Edar și activitatea de semnalizare NF-κB în dezvoltarea foliculului de păr. Se știe că A20 inhibă semnalizarea NF-κB indusă de diferite căi de semnalizare și s-a dovedit că depinde de activitatea DUB din domeniul său OTU și de ligarea ubiquitinei degetelor Zn C-terminale. Am putea demonstra că activitatea DUB A20 nu este implicată în inhibarea semnalizării EDAR.

Asemănările dintre șoarecii A20 EKO și șoarecii transgenici EDA-A1 includ defecte ale unghiilor și ale părului și hiperplazie a glandei sebacee. De asemenea, s-au dezvoltat dinți și mameloane suplimentare pentru transgenice EDA-A1, dar aceste anomalii nu au fost niciodată observate la șoarecii AKO EKO. Este posibil ca semnalizarea EDA-A1 să nu fie reglementată de A20 în aceste locuri, ceea ce se corelează cu o lipsă de expresie A20 detectabilă în codurile plăcii dinților și mugurilor mamar. De asemenea, este posibil ca formarea mugurilor dentari și mamari excesivi să necesite o activitate EDAR mai puternică, care poate fi realizată prin producția excesivă de ligand, dar nu prin eliminarea mecanismului de feedback negativ care atenuează semnalizarea. O altă explicație este că ștergerea mediată de K14-Cre a A20 ar fi putut să apară prea târziu pentru a permite inducerea primordiilor de organe ectopice, deoarece expresia K14-Cre este cea mai puternică la E15, în timp ce inducerea codurilor dentare și a laptelui începe de la E11 la E12. 41

În concluzie, am identificat că A20 este o proteină indusă de EDA-A1 care acționează ca un inhibitor al semnalizării NF-κB dependente de EDAR, independent de activitatea sa DUB. În consecință, o ștergere genetică a A20 în keratinocite afectează dezvoltarea normală a etichetei epidermice, similară cu cea observată la șoarecii transgenici care supraexprimă EDA-A1 sau EDAR.