pulmonară

  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Metaplazia cu celule scalate se dezvoltă în plămânii șoarecilor MTB infectați cronic
  • Rata metaplaziei celulelor scuamoase este controlată genetic
  • Metaplazele celulelor scuamoase duc la transformarea malignă
  • Factorii care predispun la carcinoame cu celule scuamoase sunt prezenți în leziunile pulmonare ale TBC
  • discuţie
  • Conflict de interese
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Anexa 1

abstract

Tuberculoza (TBC) rămâne una dintre principalele cauze de deces din cauza bolilor infecțioase și reprezintă o amenințare globală pentru sănătatea publică. Virulenta Mycobacterium tuberculosis (MTB) este responsabilă pentru peste 2 milioane de decese anual la nivel mondial, aproximativ o treime din populația umană purtând agentul patogen într-o formă latentă. Rezultatele infecției cu TBC variază de la boala progresivă primară, care apare la mai puțin de 10% dintre persoanele infectate, până la infecția latentă, care poate duce la reactivarea bolii la mulți ani după infecția primară sau să rămână subclinică pentru durata de viață a persoanelor infectate. TBC pulmonară se dezvoltă în aproximativ 85% din cazurile clinice și este cea mai semnificativă formă epidemiologic a bolii. Capacitatea unui agent patogen de a provoca boli pulmonare distructive la gazdele imunocompetente permite transmiterea sa efectivă prin tractul respirator în populația umană. Înțelegerea procesului inițiat de agentul patogen în plămâni este esențială pentru descifrarea strategiei sale evolutive de virulență și pentru dezvoltarea unor intervenții eficiente de control al bolii. Cu toate acestea, caracteristicile leziunilor TB în plămâni care le disting de granuloamele din alte organe rămân necunoscute.

Coexistența tuberculozei pulmonare și a cancerului a fost descrisă de mulți patologi de la primul raport Bayl din 1810 (Sakuraba și colab., 2006; Tan și Coussens, 2007). De atunci s-a sugerat că TBC pulmonară poate coexista cu diferite tipuri histologice de cancer pulmonar. De exemplu, a fost documentată o asociere strânsă a carcinomului cu celule scuamoase metastatice (SCC) al plămânului cu leziuni cu cavități TB mari (Oka și Chan, 2005). Un studiu realizat de Dacosta și Kinare în India a raportat că leziunile TB, fie active, fie curative, au fost găsite în plămâni la 30-33% dintre pacienții cu tumori bronhogene, comparativ cu 7% la populația generală (Dacosta și Kinare, 1991). Kurasawa a raportat, de asemenea, rate mai mari de coexistență a tuberculozei pulmonare și a cancerului pulmonar, care a fost reprezentată în principal de SCC în acest studiu (Kurasawa, 1998). Au fost observate rate de mortalitate excesiv de ridicate ale cancerului pulmonar la pacienții cu autopsie și nefumători cu TBC în autopsii (Sakurai și colab., 1989). Diagnosticul clinic al TB coexistente și al cancerului pulmonar este o provocare și există adesea o întârziere semnificativă în administrarea unui tratament adecvat pentru ambele afecțiuni, care este asociat cu un prognostic slab (Gopalakrishnan și colab., 1975; Ting și colab., 1976 ).

Legătura cauzală dintre cancerul pulmonar și TBC pulmonară nu este clară. Pe de o parte, reacția inflamatorie cronică asociată cu infecția latentă a tuberculozei poate servi drept cauză a malignității. Această posibilitate este susținută indirect de observațiile așa-numitelor „Scar Scar” (Cagle și colab., 1985). Ardies a emis ipoteza că, în multe cazuri, cicatrizarea plămânilor se datorează vindecării spontane după infecția recurentă cu TBC și, prin inițierea ciclurilor de procese inflamatorii și de reparare a țesuturilor, a fost creat un mediu favorabil pentru tumorigeneză (Ardies, 2003). Pe de altă parte, cancerul pulmonar se poate dezvolta autonom și poate induce apoi reactivarea TB latente prin slăbirea imunității locale. Acesta este, de asemenea, un scenariu probabil, deoarece aproape o treime din populația umană este infectată latent cu MTB. Prin urmare, o relație cauzală nu poate fi dedusă numai din corelațiile clinice. Între timp, această distincție este crucială pentru a demonstra mecanismele moleculare specifice care stau la baza coexistenței TB cu cancerul și dezvoltarea unor măsuri preventive și terapeutice raționale.

În acest studiu, prezentăm dovezi experimentale conform cărora infecția cronică cu TBC în plămâni este suficientă pentru a provoca o transformare în mai multe etape a celulelor asociate cu leziuni pulmonare TBC prin displazie de celule scuamoase în SCC malign. Am arătat că, pe lângă speciile de oxigen reactiv care afectează ADN-ul și azotul, macrofagele infectate cu MTB produc, de asemenea, cel mai puternic membru al familiei epiregulinei factorului de creștere epidermică, care poate servi ca factor de creștere paracrină în etapele inițiale ale tumorigenezei. În modelul nostru, am identificat, de asemenea, un modificator genetic puternic al tumorigenezei pulmonare induse de MTB: locusul genetic sst1 (Kramnik și colab., 2000), care controlează în mod specific deteriorarea țesuturilor și progresia TB în plămâni.

Rezultatul

Metaplazia celulelor la scară se dezvoltă în plămânii șoarecilor MTB infectați cronic

Grupurile inițiale de celule asemănătoare SCC au fost observate în plămânii descendenților F2 cu relativ rezistent la TB (C3HeB/FeJxB6.C3H-sstl) F2 după infecția iv cu MTB. În această populație sensibilă, dar altfel genetică, eterogenă, sst1, supraviețuirea a variat de la 5 la 6 săptămâni pentru mai mult de un an. Șapte supraviețuitori pe termen lung au fost uciși la 15 luni după infectare. MTB-urile vii au fost detectate în plămâni prin aplicarea omogenatului de organe. La examinarea histopatologică, am găsit grupuri de celule mari anormale asemănătoare celulelor scuamoase la patru dintre cele șapte animale, care erau ferm atașate una de alta și conțineau nuclei atipici mari. Aceste grupuri erau adiacente leziunilor inflamatorii mari, dar erau clar diferite de celulele inflamatorii din jur (Figura 1a, săgeți). Aceste celule au colorat pozitiv pentru citokeratinele 5, 6 și 14 și au ocupat zone adiacente mari ale plămânului (Figura 1b), în timp ce colorarea pentru citokeratinele 1, 8 și 10 a fost negativă (datele nu sunt prezentate).

Celule solzoase din plămâni ale șoarecilor MTB infectați cronic. A ) carcinom cu celule scuamoase în plămân de șoarece hibrid rezistent genetic (C3HeB/FeJ × B6.C3H-sstl) F2 la 15 luni după infecția MTB. Colorarea secțiunilor pulmonare cu hematoxilină și eozină (H&E). Săgeți - grupuri de celule scuamoase. Mărire originală - × 40, × 200 și × 600 (panourile din stânga, mijloc și dreapta). ( b ) Analiza imunohistochimică a țesutului pulmonar F2 de șoarece folosind anticorpi anti-citokeratină 5 (panoul din stânga), anti-citokeratină 6 (panoul din mijloc) și anti-citokeratină 14 (panoul din dreapta). Mărire originală - × 200. ( c ) Secțiuni pulmonare ale tulpinii congenitale de șoarece B6.C3H-sst1 percepute pe sst1 la 5 luni după infecția cu aerosoli MTB, colorare dublă pentru citokeratina 6 (panourile stânga și mijlocie, mărire originală - × 40 și × 400) (respectiv) și micobacterii cu aciditate rapidă (panoul din dreapta, × 400). ( d ) Fibroza masivă asociată cu leziunea pulmonară necrotică a șoarecilor B6.C3H-sstl (săgeți). Colorare tricrom, mărire originală - × 40 și × 200, panouri stânga și mijlocie. Panoul din dreapta - un grup mare de celule scuamoase într-o leziune pulmonară de tuberculoză. H&E, mărire originală - × 400.

Imagine la dimensiune completă

Am examinat în continuare dacă leziunile pulmonare necrotice tipice ale TBC dezvoltate la șoarecii B6.C3H-sst1 după o doză mică de infecție cu aerosoli au dezvoltat displazie de celule scuamoase. La cinci luni după infecția MTB, s-au găsit grupuri mari de celule citokeratin 6-pozitive la marginea leziunilor TB periferice (Figura 1c, panourile stânga și mijlocie) adiacente regiunii necrotice centrale care conțin micobacterii (Figura 1c, panoul din dreapta)., panoul drept) și au fost înconjurate de țesut fibrotic masiv (imaginea ld, panoul stâng și mijloc).

În ambele experimente, diagnosticul nostru preliminar a fost metaplazia cu celule scuamoase a celulelor alveolare cu posibilă transformare malignă.

Rata metaplaziei celulelor scuamoase este controlată genetic

Am comparat apariția celulelor metaplastice în leziunile pulmonare TB ale următoarelor tulpini de șoarece: C3HeB/FeJ (o tulpină sensibilă la TB care poartă alela originală perceptibilă a locusului sst1), sst1 B6.C3H-sstl congenic. (sensibilitate moderată la TB) și C57BL/6J (rezistent). După cum se arată în Figura 2, după infecția cu aerosoli cu MTB virulent cu doză mică, aceste tulpini au diferit în ceea ce privește supraviețuirea (Figura 2a), capacitatea lor de a controla proliferarea MTB în plămâni (Figura 2b) și gradul de pneumonie (Figura 2c, prezentat 4 luni după infecție).). O apariție de celule scuamoase a fost observată în plămânii șoarecilor infectați cu MTB prin imunocolorarea cu anticorpi specifici citokeratin 6, permițând identificarea mai sensibilă a celulelor scuamoase în leziunile complexe de TB. Folosind această tehnică, nu au fost găsite celule scuamoase în plămânii șoarecilor neinfectați de orice tulpină (neprezentată).

Metaplazie celulară scalată în timpul infecției cu tuberculoză la tulpini de șoarece rezistente la MTB. A ) Curbele de supraviețuire a tulpinilor de șoarece C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl și C57BL/6J după infecție cu aerosoli cu doză mică de 30-50 CFU MTB ale tulpinii Erdman. ( b ) încărcarea micobacteriană în plămâni a tulpinilor de șoarece C3HeB/FeJ, B6.C3H-sstl și C57BL/6J, determinată prin aplicarea omogenatului pulmonar (CFU - unități care formează colonii). ( c ) leziuni inflamatorii ale plămânilor la 4 luni după infecția cu aerosoli (H&E, mărire inițială - × 40 pentru panourile superioare; × 100 pentru panourile inferioare). ( d ) Analiza celulelor pozitive de citokeratină în leziunile tuberculozei pulmonare ale șoarecilor C3HeB/FeJ, B6.C3H-sst1 și B6 (panoul stâng, mijloc și drept) la 4 luni după infecție (mărire originală - × 100),

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Imagine la dimensiune completă

În ansamblu, datele noastre arată că dezvoltarea metaplaziei cu celule scuamoase este o caracteristică comună a infecției cronice a tuberculozei în plămâni, în timp ce nici o celulă scuamoasă nu a fost asociată cu celule infectate cu MTB din splină și ficat în nici un stadiu al infecției (datele nu sunt prezentate) ). ).

Metaplazele celulelor scuamoase duc la transformarea malignă

Pe baza criteriilor morfologice, metaplazia celulelor scuamoase poate evolua către formarea SCC în etapele ulterioare ale infecției (Figura 1). Pentru a evalua activitatea proliferativă a celulelor asociate cu leziuni metaplastice, am folosit anticorpi specifici histonei fosforilate 3 care recunosc nucleii celulelor mitotice (Hendzel și colab., 1997; Inagaki și colab., 1997; Preuss și colab., 2003). La 7 luni de la infecție, o proporție mare de celule strâns asociate cu grupuri tipice de celule cu citokeratină 6-pozitive au prezentat colorare marcată a histonei nucleare 3 (Figura 3b). Acest lucru a fost observat în leziunile pulmonare metaplastice ale șoarecilor C57BL/6J și B6.C3H-sstl (Figura 3b, panourile din stânga și din dreapta).

Deoarece 80% dintre șoarecii C57BL/6J au prezentat semne de metaplazie a celulelor scuamoase la 12 luni de la infecție, unii cu semne morfologice de transformare malignă (Tabelul 1), am testat potențialul tumorigen al acestor celule direct prin transplantarea celulelor izolate din plămânii leziunilor TB a primitorilor simgenici. O suspensie cu o singură celulă a fost preparată din plămâni a cinci șoareci C57BL/6J la 12 luni după infecția MTB prin digestie cu colagenază și aproximativ 10 milioane de celule pulmonare nedespărțite (echivalent cu un plămân) au fost injectate la șoareci fie subcutanat (cinci animale), fie intraperitoneal. (cinci animale). Șoarecilor li s-a administrat medicamentul anti-TB isoniazid (INH) în apă potabilă pentru a suprima creșterea MTB. După 2 până la 3 luni de transfer celular, am observat formarea tumorii la 2 din 10 șoareci care au primit celule pulmonare, unul după subcutanat și unul după transplant intraperitoneal. Ca martor, am transplantat suspensii cu celule unice preparate din splina aceluiași șoareci infectați cu MTB în destinatari simgenici și nu am observat nicio formare tumorală.

Tumora subcutanată a fost transplantată la un beneficiar secundar care a dezvoltat, de asemenea, o tumoră mare la locul injectării subcutanate 2 luni mai târziu (Figura 3c, panoul din stânga sus). Până în prezent, au fost efectuate în total trei pasaje la intervale de două luni și nu au fost detectate micobacterii rezistente la acid în tumorile transplantate. În comparație cu tumorile pulmonare primare, tumora transplantabilă a prezentat o morfologie mai puțin diferențiată (Figura 3c, panoul din stânga jos, H&E) și conținea mai puține celule citokeratin 6-pozitive (Figura 3c, panourile din dreapta). Astfel, după transferul către primitorii simgenici, celulele derivate din leziuni pulmonare cronice de TB au indus o tumoare transplantabilă care nu a necesitat MTB pentru creșterea sa autonomă.

Factorii care predispun la carcinoame cu celule scuamoase sunt prezenți în leziunile pulmonare ale TBC

Am dorit în continuare să stabilim care dintre factorii care pot fi responsabili pentru displazia cu celule scuamoase sunt prezenți în microambientul leziunilor pulmonare ale TBC. Unul dintre factorii de creștere candidați, despre care se știe că este critic în dezvoltarea SCC, este epiregulina, un membru puternic al familiei factorilor de creștere epidermică (Toyoda și colab., 1997). Am examinat expresia genei epiregulinei în plămânii șoarecilor C57BL/6J în timpul infecției MTB prin RT-PCR cantitativă a țesutului pulmonar total. Așa cum se arată în Figura 4a, expresia epiregulinei a fost scăzută în primele 6 luni de infecție și a fost semnificativ reglată în creștere cu 12 luni, concomitent cu dezvoltarea metaplaziei celulelor scuamoase și a carcinoamelor.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a determina dacă infecția MTB ar putea induce, de asemenea, expresia epiregulinei în macrofage, macrofagele derivate din măduva osoasă au fost izolate din tulpinile C57BL/6J (bare negre) și tulpina B6.C3H-sst1 (bare albe) infectate cu MTB in vitro și cinetică expresie mRNA epiregulin a fost analizat prin RT-PCR cantitativ. Așa cum se arată în Figura 4c, reglarea ascendentă a ARNm-ului epiregulin a fost observată la tulpinile C57BL/6J și B6.C3H-sstl, la 6 ore după infecția MTB. Cinetica expresiei mRNA a epiregulinei în macrofagele infectate cu MTB sugerează că exprimarea sa a fost indusă de interacțiunea inițială a macrofagelor cu MTB, probabil prin intermediul receptorilor de taxare.

Am testat în continuare dacă epiregulina este exprimată prin macrofage de leziuni pulmonare TB in vivo. Două populații de macrofage, macrofage inflamatorii alveolare și interstițiale, au fost izolate din plămânii șoarecilor B6 la 12 luni după infecția MTB. Macrofagele alveolare au fost izolate prin spălare bronhoalveolară și macrofagele interstițiale (granulom) au fost izolate prin digestia leziunilor inflamatorii interstițiale cu colagenază. La ambele populații, macrofagele au fost îmbogățite pentru aderență plastică timp de 2 ore și izolarea totală a ARN-ului a fost efectuată fără alte stimulări. Macrofagele interstițiale au exprimat ARNm de epiregulină, în timp ce nu s-a observat expresie de epiregulină detectabilă în macrofagele alveolare (Figura 4b). Astfel, in vivo, epiregulina a fost exprimată prin macrofage inflamatorii în leziunile pulmonare de TB.

Așa cum se arată în Figura 4d, macrofagele infectate cu MTB sunt o sursă majoră de oxid nitric sintază inductibilă în leziunile pulmonare ale TB (panourile superioare). Speciile reactive de oxigen și azot sunt inductori puternici ai deteriorării ADN-ului oxidativ. Pentru a evalua acumularea de celule care se confruntă cu deteriorarea ADN-ului nuclear lângă macrofagele infectate cu MTB, am colorat leziunile TB cu anticorpi specifici pentru γ-histona2AX fosforilată, a căror apariție în nuclei sugerează rupturi de ADN dublu catenar (Bewersdorf și colab., 2006) .; Nussenzweig și Paull, 2006). Colorarea cu Γ-H2AX a arătat că colorarea nucleară cu puncție abundentă a celulelor neinfectate a înconjurat macrofagele infectate cu MTB. Aceste date indică faptul că macrofagele infectate cu MTB au un efect dublu asupra celulelor din imediata lor vecinătate, deoarece sunt o sursă de agenți care dăunează ADN-ului și o sursă de factori de creștere pentru supraviețuire.

Pentru a determina dacă încărcăturile micobacteriene mai mari sau alți factori au fost responsabili pentru dezvoltarea mai rapidă a displaziei cu celule scuamoase în plămânii șoarecilor B6.C3H-sstl, am folosit chimioterapie anti-micobacteriană cu INH pentru a controla creșterea bacteriană. După o perioadă de două luni de progresie a bolii, INH a fost administrat timp de 3 luni. La începutul tratamentului cu INH, am observat dezvoltarea leziunilor necrotice și o încărcare bacteriană de aproximativ 500-1000 de ori mai mare în plămânii șoarecilor congenitali B6C3H-sst1, care sunt inacceptabili pentru sst1. Cu toate acestea, în prezent nu au fost observate celule scuamoase în plămâni. Terapia cu INH a redus încărcătura bacteriană în organele șoarecilor B6.C3H-sst1 de până la 500 de ori, la niveluri observate în mod normal la șoarecii C57BL/6J netratați. Cu toate acestea, celulele metaplastice citokine 6-pozitive au fost ușor de detectat în plămâni a doi dintre cei trei șoareci B6C3H-sstI (Figura 5). La un animal, am observat etape avansate ale metaplaziei adiacente grupurilor mari de macrofage infectate cu MTB (Figurile 5a-c, 2 panouri din stânga, mouse-ul nr. 1). Între timp, plămânii unui alt șoarece au reprezentat o etapă anterioară a metaplaziei cu grupuri mici de celule citokeratină 6-pozitive care sunt asociate cu țesut inflamator care nu conținea nici un bacil rezistent la acid (Figurile 5a-c, panourile din dreapta).

Displazia celulară solzoasă asociată cu leziuni de tuberculoză pulmonară după chimioterapie anti-micobacteriană cu izoniazidă (INH). Șoarecii congenici C57BL/6J și B6.C3H-sstl au fost infectați cu 50.000 CFU de MTB. După 2 luni de infecție, animalele au primit INH în apă potabilă (0,1 mg/ml) timp de încă 3 luni. Animalele au fost sacrificate la 7 zile după terminarea chimioterapiei INH. Încărcarea bacteriană în plămâni a șoarecilor B6.C3H-sst1 a variat de la 5 x 104 (șoarece # 2) la 20 x 104 CFU (șoarece # 1) după tratament. În acel moment, MTB era sub nivelul de detectare (