întregii

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Screeningul proteinelor și prezentarea generală a autoantigenelor stabilite
  • Un întreg studiu proteic identifică PDILT și MAGEB2 ca noi ținte imune
  • Verificarea MAGEB2 și PDILT ca autoantigene gonadale majore
  • discuţie
  • metode
  • Probele pacienților
  • Screeningul câmpului proteic
  • Analize statistice
  • Testele de legare a ligandilor radioactivi PDILT și MAGEB2
  • Test de exprimare prin picurare digitală PCR
  • imunohistochimie
  • Analiza îmbogățirii ontologiei genetice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Set de date suplimentare
  • Comentarii

obiecte

abstract

Sindromul polimodocrin autoimun tip 1 (APS1) este o tulburare monogenică caracterizată prin manifestări multiple ale bolii autoimune. Acest lucru se datorează mutațiilor genei regulatorului autoimun (AIRE) care promovează expresia timică a mii de antigeni ai țesuturilor periferice într-un proces critic pentru determinarea toleranței imune centrale. Aici, am folosit câmpuri proteomice pentru a efectua un studiu cuprinzător al țintelor autoimune în APS1. Interogarea autoantigenelor introduse a relevat detectarea extrem de fiabilă a autoanticorpilor și, examinând un grup de peste 9.000 de proteine, am identificat în continuare MAGEB2 și PDILT drept noile autoantigene majore din APS1. Evaluarea noastră a întregului proteom a relevat o îmbogățire semnificativă a țintelor imune specifice țesutului, reflectând selectivitatea AIRE pentru această categorie de gene. Descoperirile noastre sugerează, de asemenea, că sistemul imunitar din APS1 vizează doar o porțiune foarte limitată a proteomei, spre deosebire de defectul larg în manifestarea timică asociat cu deficiența AIRE și ridică noi întrebări cu privire la ce alți factori sunt necesari pentru a afecta toleranța.

Rezultatul

Screeningul proteinelor și prezentarea generală a autoantigenelor stabilite

Imagine la dimensiune completă

Pacienții cu APS1 dezvoltă combinații complexe de manifestări autoimune. Am evaluat corelațiile dintre autoanticorpii stabiliți pentru a înțelege mai bine cum au fost interconectate răspunsurile autoimune individuale. Se specifică autoanticorpi la doi interferoni de tip 1 strâns legați; IFNW1 și IFNA1 au arătat o corelație puternică (Spearman's ρ = 0,79). În mod similar, am observat corelații între autoanticorpi la GAD2 și GAD1 (ρ = 0,70), care sunt decarboxilaze ale acidului glutamic și sunt coexprimate în celulele insulelor pancreatice și neuronii care produc acidul gamma-aminobutiric (GABA). Interesant este că am găsit și o corelație între TPH1 și DCC (ρ = 0,70), care aparțin diferitelor familii de enzime, dar ambele sunt implicate în sinteza monoaminelor și sunt co-exprimate în celulele producătoare de serotonină din sistemul nervos central și intestin (Fig. 1c).,

Un întreg studiu proteic identifică PDILT și MAGEB2 ca noi ținte imune

Am evaluat un grup complet de peste 9.000 de proteine ​​umane pentru a identifica ținte imune majore la pacienții cu APS1. Ca primă filtrare, am exclus toate țintele care nu au atins o intensitate a semnalului mai mare de 5.000 în oricare dintre serurile examinate sau mai mult de 2.000 în eșantionul negativ (câmp sondat numai cu reactiv de detectare și fără ser). Pentru a selecta semnale specifice pacientului, am comparat apoi frecvența persoanelor pozitive între pacienții cu APS1 și un grup de control sănătos folosind testul exact al lui Fisher (cut-off = medie sănătoasă + 3SD). Printre cele mai semnificative semnale, au fost identificate și excluse o serie de artefacte de contaminare în timpul tipăririi. Setul nostru adnotat de ținte imune majore în screeningul câmpului proteomic a inclus apoi unsprezece interferoni de tip 1, alte șase autoantigene cunoscute (IL22, TPH1, DDC, GAD1, GAD2 și GIF), transglutaminază 4 (TGM4) 32 și trei noi candidați autoantigeni - testicul exprimată prin izomerază disulfidică proteică (PDILT), o familie de antigeni melanom B2 (MAGEB2) și MAGEB4. Semnalele autoanticorpului sunt grupate în funcție de corelațiile lor Spearman folosind o grupare ierarhică completă a legăturilor. Distanță = 1 - corelație.

Imagine la dimensiune completă

MAGEB2 și PDILT au fost identificate ca ținte imune majore în screeningul câmpului proteomic. Autoanticorpi MAGEB2 au fost detectați la 21 din 51 (41%) pacienți cu autoanticorpi APS1 și PDILT la 19 din 51 (37%) pacienți cu APS1, în timp ce aceștia au fost absenți în grupurile de control (limită = medie sănătoasă + 3 SD) ( A ). Testele de legare la radioligand, bărbați cu infertilitate idiopatică (n = 114), au fost utilizate pentru a verifica autoanticorpii MAGEB2 și PDILT în cohorta descoperită, în cohorta de replicare a 42 de pacienți cu APS1 și în cohorte de control care au inclus femei cu insuficiență ovariană prematură (n = 114). = 76) și indivizi sănătoși (n = 91) ( b ). În general, autoanticorpii MAGEB2 au fost detectați la 31 din 92 (34%) pacienți cu APS1, la bărbații cu infertilitate idiopatică și la femeile cu insuficiență ovariană prematură și au fost absenți în toate controalele sănătoase. Autoanticorpii PDILT au fost detectați la 28 din 93 (30%) pacienți cu APS1 și nu au fost prezenți la toate bolile sănătoase și la toate bolile de control (cut-off = valoarea indicelui 15).

Imagine la dimensiune completă

Verificarea MAGEB2 și PDILT ca autoantigene gonadale majore

Am verificat distribuția țesutului de ARNm MAGEB2 și PDILT pe un panou de unsprezece țesuturi umane prin picurare digitală PCR. Transcrierile MAGEB2 și PDILT au fost detectate la niveluri ridicate în țesutul testicular și au fost absente în țesuturile non-gonadale (Figura 4a și Figura Adițională S12). Pentru a defini distribuția celulară a MAGEB2 și PDILT în testicule, am efectuat imunocolorare pe țesutul testicular uman. Celulele germinale marcate cu antiser MAGEB2 în toate etapele diferențierii. Antiserul PDILT a fost colorat predominant pentru un subset de celule germinale situate în apropierea lumenului tubului seminal, corespunzător celulelor din faza de diferențiere tardivă a spermatogenezei, în conformitate cu rapoartele anterioare 34 (Fig. 4b). Luate împreună, descoperirile noastre sugerează că MAGEB2 și PDILT sunt principalii autoantigeni gonadici în APS1.

Distribuția de ARNm MAGEB2 și PDILT a fost examinată în unsprezece probe de țesut uman prin picurare digitală PCR. Transcrierile MAGEB2 și PDILT au fost detectate în mod specific în țesutul testicular ( A ). Pentru a investiga distribuția celulară a MAGEB2 și PDILT în testicule, am efectuat imunohistochimie pe țesutul seminal uman ( b ). Celulele germinale colorate cu MAGEB2-antiser în toate etapele diferențierii. S-a observat, de asemenea, pozitivitate nucleară nespecifică. PDILT-antiserul a fost colorat predominant pe un subset de celule germinale situate în apropierea lumenului tubului seminal. Un control negativ este inclus dacă anticorpul primar a fost colorat.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

APS1 are mai multe răspunsuri autoimunitare și autoanticorpi de organe împotriva unei varietăți de țesuturi. Deși mai multe ținte imune au fost definite în studii separate, expresia autoimună a APS1 nu a fost încă surprinsă în mod cuprinzător. În acest studiu, am evaluat răspunsul celulelor B împotriva unui grup de peste 9.000 de proteine ​​umane pentru a permite profilarea detaliată a autoantigenelor cunoscute și pentru a identifica noi ținte imune în APS1. O prezentare generală a mai multor autoantigeni stabiliți a dezvăluit detectarea autoanticorpilor extrem de robustă și, examinând întregul câmp, am identificat în continuare două noi autoantigene, MAGEB2 și PDILT, care ar putea fi confirmate prin metode independente și într-o cohortă de replicare.

Studiile asupra APS1 și modelul său animal au arătat lumina asupra procesului prin care sistemul imunitar învață auto-raportarea 12. Cu toate acestea, rămâne incomplet să înțelegem modul în care un defect de toleranță centrală în deficiența AIRE se traduce prin răspunsuri autoimune, deoarece studiile cuprinzătoare ale țintelor autoimune nu au fost efectuate anterior la pacienții cu șoareci cu deficit de APS1 sau Aire. Caracterizarea noastră largă a țintelor cu celule B oferă noi mijloace de apreciere a acestor evenimente.

Mai multe explicații trebuie luate în considerare de ce răspunsul autoimun pare a fi un ordin de mărime mai limitat decât s-ar aștepta de la un defect în prezentarea antigenului dependent de AIRE. În primul rând, ar trebui să se recunoască faptul că recunoașterea antigenului este dependentă de MHC și se așteaptă ca doar un subset de autoantigene să aibă cerințele necesare pentru a fi prezentate MHC în mod eficient și pentru a provoca răspunsuri imune puternice. Efectele potențiale ale toleranței celulelor B și ale mecanismelor de toleranță periferică care pot oferi filtre suplimentare pentru dezvoltarea răspunsurilor autoimune trebuie, de asemenea, luate în considerare. Studii recente la pacienți cu APS1 au elucidat, de asemenea, rolul prezentării antigenului periferic în manifestările autoimune32. S-a constatat că autoanticorpii către enzima specifică prostatei se dezvoltă numai la bărbați și numai după vârsta de maturare a prostatei la pubertate, o indicație a expresiei antigenului periferic a fost necesară pentru dezvoltarea unui răspuns autoimun. Acest exemplu rar de autoantigen dimorf sexual sugerează că genele dependente de AIRE trebuie exprimate la periferie la un nivel suficient pentru a provoca răspunsuri autoanticorpi.

De asemenea, am examinat dacă autoprotigenele APS1 au împărțit porțiuni de caracteristici funcționale pentru a fi specifice țesutului și am căutat termeni de ontologie genică supra-reprezentați printre principalele ținte imune de pe ecran. Cel mai frecvent utilizat termen ontologic se referă la metabolismul aminoacizilor și derivaților și la semnalizarea celulelor celulare. Termenii de biosinteză a neurotransmițătorului și legarea vitaminelor s-au îmbogățit printre țintele imune (vezi tabelul suplimentar S3).

Identificăm MAGEB2 și PDILT ca noi autoantigene majore în APS1. Interesant este că atât MAGEB2, cât și PDILT sunt exprimate în mod specific în celulele germinale gonadale. MAGEB2 este un membru al unei familii de gene grupate într-o regiune dependentă de doză a fluctuației sexuale sensibile a cromozomului X și este exprimată în țesutul testicular, precum și în diferite tumori35. PDILT este o proteină specifică testiculului care arată omologie cu izulfazele disulfurice 33, 34, 41. PDILT funcționează într-un complex de chaperone specifice celulelor germinale, care este esențial pentru fertilitatea masculină 41. În special, în ciuda expresiei testiculare aparente, autoanticorpii MAGEB2 și PDILT au fost prezenți atât la bărbați, cât și la femei cu APS1. Această observație, împreună cu experiența cu autoantigenul prostatei în APS1 32, ridică întrebarea dacă MAGEB2 și PDILT pot fi exprimate și în țesuturile feminine. Genele MAGEB sunt într-adevăr exprimate în celulele germinale feminine și par să joace un rol important în gametogeneza feminină 36. Multe gene cu expresie aparentă specifică testiculului sunt, de asemenea, considerate a fi exprimate în celulele germinale feminine, iar expresia ovocitelor este ușor trecută cu vederea în analiza țesutului grosier ovarian. .

Expresia gonadică specifică a MAGEB2 și PDILT ridică întrebări dacă acești antigeni pot juca un rol în infertilitatea APS1. Infertilitatea este frecventă atât la bărbați, cât și la femei cu APS1 8. Infertilitatea feminină se explică în majoritatea cazurilor prin insuficiența ovariană prematură și autoimunitatea împotriva celulelor producătoare de steroizi ovarieni. Autoimunitatea prostatei a fost identificată recent ca o manifestare majoră a APS1 cu un rol potențial în dezvoltarea infertilității masculine 32. Identificarea MAGEB2 și PDILT relevă celulele germinale gonadale ca ținte imune majore în APS1 și descrie încă o altă componentă autoimună care ar putea contribui potențial la infertilitate la bărbați și femei cu APS1.

metode

Probele pacienților

Toți pacienții au dat consimțământul informat pentru a participa.

Screeningul câmpului proteic

Testarea și scanarea câmpului de proteine ​​(ProtoArray® v5.0 PAH0525020, Life Technology) a fost efectuată conform protocolului de profilare a răspunsului imun Invitrogen BioMarker folosind reactivul de detecție recomandat (Alexa Fluor® 647 Capră anti-IgG A21445 umană, Invitrogen) și tampon de blocare ( tampon de blocare) kit tampon PA055, Invitrogen). Câmpurile au fost analizate cu ser la o diluție de 1: 2000. Câmpurile au fost scanate utilizând un scaner GenePix 4000B microarray și software-ul GenePix® Pro microarray (v6.1) a fost utilizat pentru alinierea și achiziția datelor.

Analize statistice

Analizele statistice ale datelor din câmpul proteomic au fost efectuate la intensități transformate în log. Testul exact al lui Fisher a fost utilizat pentru a clasifica țintele de câmp proteic care difereau între pacientul cu APS1 și grupul de control sănătos. Un semnal a fost considerat pozitiv dacă valoarea intensității a fost peste media sănătoasă + 3SD.

Testele de legare a ligandilor radioactivi PDILT și MAGEB2

Autoanticorpii către PDILT și MAGEB2 au fost măsurați utilizând teste de legare la radioligand. Clonele ADNc umane pentru PDILT (SC306958, Origene, numărul de acces NM_174924) și MAGEB2 (SC122625, Origene, numărul de acces NM_002364) au fost clonate în vectorul de expresie pTNT (L5610, Promega) și transcrise și traduse in vitro în prezența 35 S metionină TNT Systems). Imunoprecipitarea a fost efectuată în plăci de filtrare cu 96 de godeuri (Millipore). Un standard pozitiv, un ser de pacient APS1 cu reactivitate cunoscută și un standard negativ, 4% BSA, au fost incluse pe fiecare placă. La fiecare godeu s-au adăugat 30 000 CPM de proteină marcată radio și 2,5 pl de probă de ser. Toate serurile au fost analizate de două ori. Anticorpii serici au fost imobilizați la proteina A Sepharose (nProtein A Sepharose TM 4 Fast Flow, GE Health Care) în timpul incubării peste noapte. Radioactivitatea a fost măsurată într-un contor micro-beta (1450 Microbeta Trilux, Wallac). Valorile indicelui autoanticorp au fost calculate în funcție de următoarele: (valoare eșantion/valoare standard negativă)/(valoare standard pozitivă/valoare standard negativă) × 100.

Test de exprimare prin picurare digitală PCR

ARN-ul total de la Origene a fost convertit în ADNc folosind kitul de sinteză ADNc cu catenă dublă Life Technologies și protocolul cu hexameri aleatori (N8080127, Life Technologies) pentru prima sinteză a catenelor. S-a folosit supermix ddPCR de la Bio-Rad pentru sonde (186-3040, BioRad) și s-a realizat generarea de picături conform protocolului standard al BioRad cu sonde TagMan la PDILT și MAGEB2 și β2M ca control (1206926, 4351372 și 4448489, Life Technologies). Probele au fost rulate pe o mașină Quantalife ddPCR și software-ul Quantasoft a fost utilizat pentru a colecta și analiza date.

imunohistochimie

Colorarea pentru MAGEB2 și PDILT a fost efectuată pe țesut testicular uman încorporat în parafină fixată în formalină folosind Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific). Diapozitivele pentru țesut au fost incubate mai întâi cu bloc Ultra V (TA-125-UB, Thermo Fisher Scientific, Inc.) timp de 5 minute și apoi incubate fie cu anti-MAGEB2 (49-718, ProSci) la diluție 1: 1750, fie cu anti- PDILT (HPA041923, Sigma) la 1: 1000 diluție timp de 30 de minute. Diapozitivele au fost apoi incubate cu peroxidază-polimer de hrean marcat timp de 30 de minute, urmate de soluție de 3, 3'-diaminobenzidină (DAB) timp de 2 × 5 minute. Diapozitivele au fost contracolorate în hematoxilină Mayers (01820, Histolab) timp de 5 minute folosind Autostainer XL (Leica) și apoi clătite în apă de carbonat de litiu (diluată 1: 5 din soluție saturată) timp de 1 minut. Diapozitivele au fost deshidratate în etanol gradat și în cele din urmă acoperite (PERTEX, Histolab) folosind un capac de sticlă automat (CV5030, Leica). Diapozitivele au fost scanate folosind sistemul automat de scanare Aperio XT (Aperio Technologies).

Analiza îmbogățirii ontologiei genetice

Pentru a găsi termeni ai ontologiei genetice suprareprezentate statistic (baza de date GOa-umană) atribuiți autoantigenilor prezenți în matrice, am folosit software-ul online GOstat 45. Pentru a evita ca interferonii să depășească complet alte gene în analiza de îmbogățire a termenului GO, interferonii au fost reprezentați doar de IFNA13 și IFNW1.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Landegren, N. și colab. Studiu la nivel proteic al repertoriului țintă autoimun în sindromul polendocrin autoimun de tip 1. Ști. reprezentant. 6, 20104; doi: 10.1038/srep20104 (2016).

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Set de date suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.