abstract

Adipocitele umane pot fi obținute in vitro prin diferențierea preadipocitelor umane sau a celulelor stem mezenchimale (hMSC). Deși funcțional similar cu celulele proaspăt izolate, nu s-a făcut nicio comparație detaliată a diferitelor tipuri de celule. Α 2A-adrenoceptorul antilipolitic (AR) și enzima degradantă AMPc fosfodiesterază-3B (PDE3B) sunt implicate în reglarea fină a lipolizei, dar se știe puțin despre rolul lor în adipocitele umane sau dacă exprimarea și/sau funcția lor diferă . în celulele adipoase de la diverși precursori.

metodologie:

Efectele inhibării α2A-AR și PDE3B în adipocite mature au fost determinate și comparate cu efectele în preadipocite diferențiate și celule adipoase derivate din hMSC. Expresia genei a fost determinată prin PCR în timp real și expresia proteinelor prin Western blot.

rezultatele:

Noradrenalina (NA) a stimulat lipoliza în preadipocite și adipocite mature, dar a redus semnificativ lipoliza în adipocitele diferențiate derivate din hMSC. Acest lucru s-a datorat stimulării puternice a α2A -AR după co-incubație cu NA și inhibitor și -2-AR-yohimbină, lipoliza indusă de NA a fost restabilită. Ordinea răspunsului Yohimbine a fost hMSC> preadipocite> adipocite mature. Deși expresia mARN-ului α2-AR a fost cea mai mare la adipocitele mature, nu a existat nicio diferență în nivelurile de proteine ​​α2A-AR între tipurile de celule. În schimb, expresia ARNm și proteine ​​G α2 a fost semnificativ mai mare în adipocitele derivate din MSC, sugerând că diferențele în răspunsul la inhibarea α2A-AR se află la nivelul post-receptor. Incubarea cu cAMP analog 8-bromo (8b) cAMP a crescut lipoliza în adipocitele derivate din hMSC, în timp ce co-incubația cu inhibitorul specific PDE3 OPC3911 nu a modificat efectul lipolitic. În schimb, OPC3911 a crescut semnificativ lipoliza indusă de 8bcAMP în preadipocite și adipocite mature. Răspunsul la inhibarea PDE3B a fost; adipocite mature> preadipocite> constatare hMSC, care s-au corelat semnificativ cu expresia mARN-ului PDE3B precum și cu activitatea enzimatică.

concluzie:

Deși adipocitele diferențiate de diferite origini prezintă caracteristici funcționale similare, există diferențe semnificative în reglarea lipolizei cu α 2A-AR marcat și efect mai puțin pronunțat al PDE3B în adipocitele MSC.

Reglarea nivelurilor AMPc se realizează și la un nivel diferit de fosfodiesteraze (PDE), un grup de enzime care degradează AMPc la activarea hormonilor antilipolitici precum insulina. Subtipul major al PDE în țesutul adipos uman este fosfodiesteraza-3B (PDE3B). Stimularea insulinei în adipocite are ca rezultat autofosforilarea receptorului de insulină și legarea proteinelor adaptoare, inclusiv substratul receptorului de insulină-1 (IRS-1). Proteinele adaptoare dobândesc mai mulți efectori, inclusiv fosfatidilinozitol trifosfat kinază (PI3-K). Lipidul fosfatidil trifosfat format prin fosforilarea PI3-K funcționează ca o moleculă de ancoră și recrutează kinaza PDK1/2 în membrana plasmatică. PDK1/2 fosforilează protein kinaza B (PKB), enzima responsabilă de fosforilarea și activarea PDE3. Această cascadă de semnalizare are ca rezultat scăderea concentrațiilor de AMPc, ceea ce duce la reducerea activității PKA și a defosforilării HSL. La adipocitele umane, antilipoliza indusă de insulină este complet neutralizată de inhibitorul selectiv PDE3 OPC3911. În combinație cu alte studii6, acest lucru sugerează că activarea PDE3 este un mecanism major al efectului antilipolitic in vivo al insulinei.

Materiale și metode

Cultură de celule adipocitare

În culturile de adipocite și preadipocite mature, grăsimea a fost obținută de la 13 femei care au suferit mastectomie cosmetică sau chirurgie abdominală. Aveau vârsta cuprinsă între 28 și 62 de ani, cu un indice de masă corporală (IMC) între 24 și 51 kg/m 2. Probele de țesut adipos au fost obținute de la secțiile chirurgicale ale spitalului Huddinge și spitalului Danderyd. Probele au fost prelevate din depozitul subcutanat al pacientului și din depozitele abdominale. Comitetul de etică al spitalului a aprobat studiul. Consimțământul informat a fost obținut de la fiecare subiect. Adipocitele mature au fost izolate conform lui Rodbell. 13 După izolare, celulele au fost spălate cu tampon fosfat Krebs-Ringer (KRP) pH 7,4, 0,9% NaCl, 0,1 M NaH 2 PO 4, 0,154 M KCl, 0,1 M M Cl 2, 0,154 M MgSO 4, conținând 0,1% ser albumină bovină (BSA) pH 7,1, 4. Adipocitele au fost apoi diluate în KRP conținând 2% BSA (acceptor FFA), glucoză (combustibil, 1 mg/ml) și acid ascorbic (antioxidant, 0,1 mg/ml).

Culturile umane de preadipocite au fost înființate și diferențiate așa cum este descris mai sus 14 în plăci cu 6, 12 sau 24 de godeuri într-un incubator la 37 ° C cu 5% CO2. Lipoliza a fost evaluată în ziua 16 de diferențiere.

Cultura MSc umană

Evaluarea diferențierii

Diferențierea de preadipocite și hMSC a fost evaluată prin determinarea activității glicerol-3-fosfat dehidrogenazei (GPDH) și colorarea cu colorant roșu roșu specific pentru trigliceride, așa cum este descris mai sus. 10

Izolarea în timp real a ARN și PCR

lipoliza

Western blot

Testul activității PDE3B

Testul PDE se bazează pe următoarea reacție: AMPc în AMP (catalizat de PDE) și apoi conversia AMP în adenozină prin 5'-nucleotidază. Preadipocite și hMSC diferențiate, precum și adipocite mature au fost omogenizate într-un tampon conținând 50 mM TES, 250 mM zaharoză, 1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA (pH 7,5) și Complete (Roche Diagnostics, Elveția). Omogenatele celulare au fost incubate la 30 ° C timp de 20 minute într-un volum total de 300 μl conținând 50 mM HEPES (pH 7,4), 0,1 mM EGTA și 0,5 μM [3 H] cAMP. Venin de șarpe (Crotalus atrox, Sigma, St. Louis, MO, SUA), care conține activitate 5'-nucleotidază, a fost adăugat la o concentrație de 0,4 mg/ml, iar omogenatele celulare au fost incubate la 37 ° C timp de 20 de minute. Activitatea PDE3 a fost definită ca cantitatea de AMPc hidrolizat și exprimată pe mg de proteină totală. Concentrația de proteine ​​în omogenatele celulare a fost determinată folosind testul proteinei RC/DC (Biorad, Hercules, CA, SUA).

analize statistice

Valorile sunt raportate ca medie ± deviație standard (sd) pentru datele de testare mRNA și PDE și ca medie ± eroare standard (se) pentru lipoliză. Acestea au fost comparate cu testul t nepereche studențesc sau testul neparametric Kruskal-Wallis, așa cum indică pachetele software standard.

Droguri și substanțe chimice

Fracția BSA V (numărul lotului A-9418), 8-bromocAMP, glucoză, glicerol kinază, NA, Red Oil O și yohimbină au fost obținute de la Sigma Chemical (Sigma, St. Louis, MO, SUA). OPC 3911 a fost obținut de la Otsuka Pharmaceuticals, Japonia. Toate substanțele chimice utilizate au avut cel mai înalt grad de puritate disponibil comercial.

Rezultatul

Adipocitele derivate din hMSC prezintă un efect α2A-AR marcat, dar nu un efect PDE3B

diferențială

Lipoliza în adipocite derivate din hMSC. Celulele au fost stimulate fie cu NA (NA) cu sau fără blocant α2A -AR yohimbină (NA + Yoh) sau analogul AMPc 8pcAMP sensibil la fosfodiesterază 3 (PDE3) cu sau fără inhibitorul specific PDE3 OPC3911 (8bcAMP + OPC). Eliberarea de glicerol a fost măsurată în mediu după 3 ore de incubație și exprimată în raport cu activitatea GPDH și concentrația de proteine. Lipoliza bazală a fost ajustată la 100% pentru fiecare experiment care a fost repetat de cel puțin patru ori cu celule de la donatori diferiți. Datorită efectului antilipolitic puternic al α2A -AR, NA a redus lipoliza în comparație cu celulele martor. În prezența yohimbinei, lipoliza stimulată de NA a fost restabilită de mai mult de trei ori la nivel bazal. În contrast, adăugarea de OPC la 8bcAMP nu a avut niciun efect semnificativ asupra ratei lipolitice (***, semnificativă statistic comparativ cu lipoliza P bazală

Lipoliza în preadipocite diferențiate. Rețineți că lipoliza indusă de NA este îmbunătățită în prezența yohimbinei. În mod similar, efectul 8bcAMP a fost semnificativ îmbunătățit în prezența OPC3911 (***, semnificativ statistic comparativ cu lipoliza P bazală

Lipoliza în adipocite mature proaspăt izolate. Celulele au fost stimulate cu aceleași medicamente ca în Figura 1. Eliberarea glicerinei a fost măsurată în mediu după 2 ore de incubație și exprimată în raport cu conținutul de lipide în grame. Rețineți efectul ușor mai puțin pronunțat al inhibării α2A -AR și efectul marcat al inhibării PDE3B (* P *** P preadipocite> adipocite mature), în timp ce activitatea inversă (adipocite mature> preadipocite)> HMSC-adipocite este observată cu activitatea PDE3B).

Comparația efectelor inhibitoare în diferite tipuri de celule. Efectul antilipolitic al α2A -AR a fost exprimat ca creșterea procentuală a lipolizei în celulele tratate cu NA + yohimbină comparativ cu celulele incubate numai în NA. Efectul antilipolitic al PDE3 a fost exprimat ca creșterea procentuală a lipolizei celulelor tratate cu 8bcAMP + OPC comparativ cu 8bcAMP. Efectul antilipolitic al α2-adrenoceptorilor a fost semnificativ mai scăzut la adipocitele mature, comparativ cu hMSC diferențiate (P = 0,002, testul t Student). ). În schimb, efectul antilipolitic al PDE3 a fost semnificativ crescut la adipocitele mature, comparativ cu hMSC diferențiate (P = 0,036, testul t Student).

Imagine la dimensiune completă

Exprimarea ARNm și proteinei α2A-AR și Galfa

Exprimarea Messenger și a proteinelor în adipocite de diferite origini. Expresia ARNm α2A-AR (a) și Gai2 (b) a fost evaluată în adipocite izolate, preadipocite și hMSC. Expresia genică a fost standardizată la ARNr 18S. Valorile sunt afișate ca medie ± sd (* = P

Spre deosebire de efectul redus al inhibării α2A -AR la adipocitele mature, efectul PDE3 pare să fie îmbunătățit. Acest lucru se datorează cel mai probabil expresiei crescute a mARN-ului PDE3B, ducând la creșterea activității. Motivul pentru aceasta nu este clar. PDE3 este un efect major al efectului antilipolitic al insulinei. Prin urmare, creșterea activității PDE3 ar putea reflecta un nivel mai avansat de reglare lipolitică în celulele adipoase mature, unde lipoliza este reglementată nu numai de catecolamine, ci și de insulină. Cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a determina dacă diferențele de exprimare depind de diferențele primare dintre tipurile de celule sau datorate unei proceduri de diferențiere in vitro.

În rezumat, am arătat că funcțiile α2A -AR și PDE3B diferă în funcție de originea adipogenă a celulelor adipoase maturate. Inhibarea lipolizei de către α2A -AR și PDE3B pare a fi diferențiat de importantă pentru adipocitele obținute din diferite origini celulare. Rolul α2A -AR predomină în adipocite derivate din hMSC, în timp ce activitatea PDE3B predomină în adipocite mature. Ambele căi sunt importante în preadipocite. Aceste semnale pot juca un rol în acumularea de lipide în timpul maturării adipocitelor pentru a proteja celula grasă imatură prin inhibarea eliberării necontrolate a energiei stocate. Rezultatele noastre indică faptul că există diferențe calitative între adipocitele umane derivate din diferite celule precursoare și că ar trebui să se acorde prudență atunci când se interpretează rezultatele studiilor adipocite in vitro.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de fundațiile lui Åke Wiberg, Tore Nilsson, Signe și Olof Wallenius, Magnus Bergvall, Åhlens și Novo Nordisk, Asociația medicală suedeză, Consiliul suedez de cercetare, Asociația suedeză pentru diabet, Fundația Tobias și Fundația suedeză pentru cancer .,