răcnet

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Degradarea cofeinei în H. hampei
  • Analiza biogeografică a microbiomului H. hampei
  • Bacterii care degradează cofeina în intestin H. hampei
  • Profiluri de oxigen în intestin H. hampei
  • Refacerea degradării cofeinei în H. hampei
  • discuţie
  • metode
  • Probele de insecte
  • Extracția ADN-ului, amplificarea PCR și secvențierea de înaltă performanță
  • Analiza genelor ARNr 16S
  • Izolarea bacteriilor care degradează cofeina și identificarea acestora
  • Screeningul genetic ndmA izolat și H. hampei
  • Măsurători O 2 folosind microelectrozi
  • Timp de dietă-tranzit în H. hampei
  • Tratament antibiotic și reinfecție
  • Detectarea cofeinei în probe de frass
  • Efectul antibioticelor asupra reproducerii H. hampei
  • trepte
  • GenBank/EMBL/DDBJ
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Videoclipuri
  • Film complementar 1
  • Fișiere Excel
  • Informații suplimentare 1
  • Comentarii

obiecte

  • entomologie
  • Ecologie microbiană
  • microbiom

abstract

Burghiul de cafea cu fructe de pădure (Hypothenemus hampei) este cel mai distructiv dăunător de insecte din lume, infestând insecte și reducând randamentul acestora cu până la 80%. Cofeina este un alcaloid care poate fi toxic pentru insecte și se crede că acționează ca un mecanism de apărare care inhibă erbivorul. Aici arătăm că cofeina este degradată în intestinul H. hampei și că inactivarea experimentală a microbiotei intestinale elimină această activitate. Arătăm că microbiotii intestinali din exemplarele H. hampei din cele șapte țări mari producătoare de cafea și din coloniile crescute în laborator împărtășesc nucleul microorganismelor. Membrii la nivel global ai microbiotei intestinale, inclusiv specii proeminente de Pseudomonas, trăiesc pe cofeină ca singură sursă de carbon și azot. Genele de cafeină demetilază Pseudomonas sunt exprimate in vivo în intestinul H. hampei, iar revaccinarea insectelor tratate cu antibiotice cu o tulpină izolată de Pseudomonas restabilește capacitatea de degradare a cofeinei, confirmând rolul lor cheie.

La insecte, ca și la alte animale, degradarea cofeinei poate fi catalizată de enzimele citocromului P450 20, 21. Cu toate acestea, nu au fost raportate alte metazoane care să reziste concentrațiilor de cofeină la care este expus H. hampei, în același timp supraviețuind și completând întregul ciclu de viață exclusiv pe boabe de cafea verde. Am emis ipoteza că degradarea cofeinei din H. hampei este mediată în primul rând de activitatea microbiotei sale intestinale. Aici vă prezentăm primul studiu al microbiomului H. hampei și rolul său în detoxifierea cofeinei la insecte. Descoperirea noastră a componentei microbiene pentru transformarea cofeinei și a existenței H. hampei pe boabele de cafea are implicații importante pentru înțelegerea metabolismului și ecologiei acestui mare dăunător.

Rezultatul

Degradarea cofeinei în H. ​​hampei

Pentru a testa ipoteza că degradarea cofeinei este un proces mediat microbial în H. ​​hampei, am obținut probe din șapte regiuni producătoare de cafea dispersate geografic: Kenya (Kiambu), Indonezia (Java de Est), India (Karnataka), Puerto Rico (Adjuntas), Hawaii. (Kona), Guatemala (Coatepeque) și Mexic (Chiapas). Specimenele din India au inclus și insecte prelevate din ambele specii dominante de Coffea (C. arabica și C. canephora). De asemenea, am folosit colonii asistate de laborator, originare din populația columbiană de H. hampei și alte trei specii de crustacee care nu pot trăi pe boabe de cafea (H. crudiae, H. eruditus și Scolytodes maurus).

Am testat mai întâi degradarea cofeinei după ce am trecut prin intestinul insectelor și am stabilit dacă microbiota intestinală a fost responsabilă de acest proces. Această ipoteză a fost testată folosind o colonie de H. hampei într-un laborator crescut într-un experiment controlat folosind o dietă artificială (denumită aici dieta minimă) care conține boabe de cafea verde de C. arabica cu o concentrație finală de cofeină de 8 1,8-2,2 mg -1. Probele de Hypothenemus hampei au fost introduse în flacoane care conțin această dietă definită și au prezentat activitate tipic plictisitoare (Film suplimentar 1) și producția de fracțiuni. Cantitatea de alimente consumate și timpul de ședere al alimentelor în tractul digestiv al H. hampei au fost determinate prin încorporarea în dietă a indicatorilor sferici fluorescenți. Timpul de ședere a fost de obicei 3 ore (Figura 1 suplimentară) și a corespuns greutății

Tabel în dimensiune completă

A ) Proiectarea experimentală și analiza concentrațiilor de cofeină într-o probă de H. hampei într-o probă de control și pentru antibiotice. Depleția microbiomului H. hampei mediată de antibiotice elimină transformarea cofeinei și crește secreția de cofeină. b ) Profiluri FTIR pentru cofeină pură (neagră), martor (insecte fără antibiotice - roșu) și fragment de insectă tratat cu antibiotice (verde). Profilurile afișate reprezintă media tuturor măsurătorilor (n = 6).

Imagine la dimensiune completă

Analiza biogeografică a microbiomului H. hampei

Pentru a identifica membrii bacteriei intestinale H. hampei care pot contribui la degradarea cofeinei, am analizat compoziția bacteriană a comunităților microbiene H. hampei utilizând secvențierea genei 16S rRNA din eșantioane din principalele regiuni producătoare de cafea (date suplimentare 1). Diversitatea β-filogenetică și gruparea ierarhică au arătat separarea microbilor în funcție de originea geografică (Figura suplimentară 4). Analiza împrăștierii multivariate de permutare nonparametrică a fost utilizată pentru a distribui varianța în compoziția microbiană printre factorii cheie. Amplasarea geografică a explicat o mare parte a varianței (45%) a compoziției bacteriene (Figura suplimentară 4). În locurile în care s-au schimbat soiurile de cafea (India; C. arabica și C. canephora), soiurile de cafea au reprezentat 78% din varianța compoziției microbiene. Deși taxonii microbieni dominanți s-au schimbat și din punct de vedere geografic, analiza rețelei a arătat nucleul organismelor detectate la toate siturile (Fig. 2a). Aceste organisme au fost asociate, printre altele, cu seriile Pseudomonadales, Enterobacteriales, Turicibacteriales, Rhizobiales, Alteromonadales, Actinomycetales; întrucât pseudomonadalele au fost extrem de abundente în toate eșantioanele prelevate (Fig. 2b).

A ) Analiza filogenetică a rețelei care arată grupuri bacteriene dominante asociate cu probe de H. hampei din cele șapte țări principale producătoare de cafea. Insectele din Mexic au inclus și insecte din alte specii decât H. hampei. ◊, H. hampei, - S. maurus; A, H. crudiae; □, H. eruditus . b ) Acțiuni ale Pseudomonas spp. secvențe în microbiomul probelor colectate.

Imagine la dimensiune completă

Bacterii care degradează cofeina din intestinul H. hampei

A ) Placă cu gradient de cafeină care prezintă colonii bacteriene izolate din tractul gastro-intestinal al H. hampei și identitatea lor determinată prin analize filogenetice. Principalul grup de izolate obținut a fost P. fulva . b ) Arborele filogenetic pentru secvențe de subunități alfa de cofeină alfa-demetilază (NdmA) obținute din bacterii izolate (galbene) și, de asemenea, din ARN extras din probe de câmp de H. hampei (verde). c ) Probele de H. hampei vechi de patru săptămâni tratate anterior cu antibiotice au fost inoculate cu P. fulva pentru a-și restabili capacitatea de degradare a cofeinei, după cum s-a demonstrat prin măsurători ale cofeinei FTIR și GC-MS în fracțiunea lor (vezi Tabelul 1).

Imagine la dimensiune completă

Profiluri de oxigen în intestinul lui H. hampei

Gradienții de oxigen au fost măsurați în intestinul H. hampei folosind microelectrozi. Toate măsurătorile au fost făcute în jumătatea anterioară a gândacului (vezi figura suplimentară 1). În timpul acestor proceduri, vârful electrodului a fost adus la suprafața peretelui intestinal și ținut în poziție până când concentrațiile măsurate de O 2 s-au stabilizat. În toate cazurile, când vârful a pătruns în peretele intestinal, concentrațiile de oxigen au scăzut cu gradienți abrupți care trec de la condiții microaerofile la nucleul anaerob redus (Figura 4).

Figura prezintă profilurile de oxigen ale celor trei intestine ale gândacilor. Rețineți tranziția de la regiunea microaerofilă la nucleul anaerob din lumenul intestinului mediu anterior (a se vedea figura suplimentară 1).

Imagine la dimensiune completă

Restaurarea degradării cofeinei în H. ​​hampei

Probele de laborator H. hampei tratate cu antibiotice au fost hrănite mai întâi cu o dietă minimă conținând P. fulva timp de 1 săptămână. Insectele au fost apoi transferate într-o dietă minimă sterilă proaspăt preparată și lăsate să se hrănească timp de 4 ore înainte ca fracția să fie colectată și concentrațiile de cofeină să fie cuantificate. Analizele GC-MS și FTIR au arătat epuizarea aproape completă a conținutului de cofeină din fracțiunea de insecte re-infectate (Fig. 3c, Tabelul 1). A fost testată și capacitatea de reproducere a insectelor tratate cu antibiotice și P. fulva. Insectele nu și-au redat capacitatea de reproducere după vaccinarea cu P. fulva (Figura suplimentară 3).

discuţie

Deși alte insecte au fost uneori hrănite cu semințe de cafea 24, H. hampei este singura insectă specializată în hrănire și încheierea întregului ciclu de viață exclusiv în boabele de cafea din boabele 16, 25. În timpul supraviețuirii în acest mediu, H. hampei este expus expunerii cronice la cofeină, cunoscut sub numele de alcaloid toxic 3, 5, 7, 9, 10, făcând din această insectă un sistem model atractiv în care să evalueze rolul microbilor în adaptarea animalelor la mediu neobișnuit. În acest studiu, am testat dacă degradarea cofeinei din H. hampei este mediată de microbiul intestinal al insectelor.

Membrii microbiotei intestinale H. hampei au fost identificați din insecte colectate din șapte țări producătoare de cafea și colonii de laborator. Analizele calculate ale distribuției și varianței β-diversității au arătat că compoziția microbiomului H. hampei a fost asociată în mod semnificativ cu originea geografică a cafelei și, de asemenea, cu tipurile de cafea în care acestea variau (a se vedea datele suplimentare 1). Formarea unităților morfocryptice a fost demonstrată anterior în probele de H. hampei prelevate din diferite țări producătoare de cafea prin analiza markerilor microsateliți și a secvențelor genei COI 30. Aceste „complexe de specii” raportate, împreună cu constatările noastre privind variația geografică a comunităților microbiene din H. hampei, pot indica coevolutia insectelor și a microbiotilor acestora. Conținutul de cofeină variază semnificativ între speciile de cafea evaluate 31 și, deși nu a fost testat aici, concentrația de cofeină poate fi un alt factor important care influențează compoziția microbomilor intestinali H. hampei.

Pentru a confirma rolul P. fulva în degradarea cofeinei in vivo, probele de laborator tratate cu antibiotice au fost reinfectate cu P. fulva. Insectele au fost apoi hrănite cu o dietă sterilă minimă și fracțiile lor au fost colectate pentru cuantificarea cofeinei. Acest lucru a demonstrat că re-inocularea P. fulva a restabilit capacitatea lui H. hampei de a degrada cofeina (Fig. 3c, Tabelul 1), confirmând importanța acestui membru al microbiotei intestinale în procesul de detoxifiere a cofeinei. Pentru a testa dacă P. fulva singur poate ajuta H. hampei să-și regenereze capacitatea de reproducere, un al treilea grup de insecte tratate cu antibiotice sunt inoculate cu P. fulva și utilizate pentru a evalua adecvarea. Cu toate acestea, insecta nu și-a recăpătat capacitatea de reproducere după inoculare. Un proces la fel de complex ca reproducerea poate necesita o stare nutrițională adecvată a insectelor, care se bazează parțial pe activitatea metabolică a microbilor asociați, sau poate necesita prezența altor endosimboni bacterieni cunoscute pentru a afecta sănătatea reproducerii 34. Determinarea setului minim de microorganisme pentru a restabili capacitatea de reproducere, precum și compararea efectului speciilor de cafea cu concentrații diferite de cofeină asupra comunităților microbiene asociate cu H. hampei sunt subiecte importante pentru cercetări ulterioare.

Aici demonstrăm că H. hampei, cel mai distructiv dăunător al cafelei din țările producătoare de cafea, împărtășește un nucleu comun de microbiota intestinală care este împărțit între indivizi din diferite zone geografice și că multe dintre aceste organisme pot exista pe bază de cofeină ca fiind singura lor sursă. carbon și azot. De asemenea, demonstrăm că H. hampei microbiota este responsabilă pentru degradarea cofeinei din tractul digestiv al insectelor. Comunitățile microbiene joacă un rol important în toate ecosistemele, de la participarea la ciclul nutrienților solului până la modelarea sistemului imunitar uman 35, 36, 37. Demonstrația noastră despre rolul microbiotei intestinale în detoxifierea cofeinei în H. ​​hampei are implicații importante pentru înțelegerea metabolismului și ecologiei acestui important dăunător al cafelei. De asemenea, oferă noi oportunități pentru dezvoltarea strategiilor de biocontrol, unde microbiomul reprezintă un nou obiectiv, deoarece rolul microorganismelor asociate în capacitatea îmbunătățită a gazdei de a supraviețui și de a domina într-un mediu ostil.

metode

Probele de insecte

Probele de H. hampei (n = 68; date suplimentare 1) au fost obținute din Kenya (Kiambu), Indonezia (Java de Est), India (Karnataka), Puerto Rico (Adjuntas), Hawaii (Kona), Guatemala (Coatepeque) și Mexic ( Chiapas Informații suplimentare 1). Insecte din India au fost colectate de la C. arabica și hibridul robusta (C. congensis × C. canephora). H. obscurus, H. crudiae și S. maurus au fost obținute din tulpini de frunze Cecropia din Chiapas, Mexic. În scopul studiului și comparării biogeografice, au fost incluse, de asemenea, fructe de cafea artificiale 38 (insecte de laborator). La toate locurile de colectare, insecte individuale au fost plasate în viață în tuburi care conțin ARN mai târziu (Ambion, Grand Island, NY, SUA) și trimise la un laborator pentru analiză.

Extracția ADN-ului, amplificarea PCR și secvențierea de înaltă performanță

Analiza genelor ARNr 16S

Izolarea bacteriilor care degradează cofeina și identificarea acestora

Screeningul genei ndmA în izolate și H. hampei

Măsurători O 2 folosind microelectrozi

Durata de tranzit a dietei în H. ​​hampei

Tratament antibiotic și reinfecție

Detectarea cofeinei în probe de frass

Au fost utilizate două strategii pentru a determina concentrația de cofeină în probe de gândaci tratați cu antibiotice, infectați cu antibiotice și gândaci de control: măsurarea cofeinei din așchii brute prin FTIR și măsurarea cofeinei extrase din așchii de lemn de către GC-MS,

Pentru analizele FTIR și GC-MS, diferențele semnificative între tratamente (martor, tratate cu antibiotice și tratate cu antibiotice/re-inoculate) au fost determinate prin analiza unidirecțională a varianței și cele mai mici diferențe semnificative utilizând mediul software R 53. .

Efectul antibioticelor asupra reproducerii H. hampei

O sută de femele au apărut recent când adulții au fost plasați cu 20 de masculi în flacoane care conțin o dietă obișnuită și incubate timp de 14 zile pentru a maximiza împerecherea. După incubația inițială de împerechere, femeile individuale au fost transferate într-un flacon conținând fie o dietă regulată (martor), fie o dietă suplimentată cu antibiotice (așa cum este descris mai sus) și incubate timp de 44 de zile. Un al treilea grup de femele împerecheate a fost tratat cu antibiotice timp de 3 săptămâni, a urmat dietă cu P. fulva și, de asemenea, a fost incubat timp de 44 de zile. Cincisprezece fiole din fiecare tratament au fost colectate distructiv la fiecare moment de prelevare (zilele 14, 24, 34 și 44) și examinate pentru ouă, larve, pupe și adulți. A fost efectuată o regresie logică la suma tuturor fazelor din fiecare fiolă. Apoi, modelul a fost potrivit numai cu principalele efecte (DIET - control, antibiotice, infecție și SAMPLE - timp de eșantionare), unde a fost inclusă dispersia excesivă. Ambele efecte principale au fost semnificative, adică există un efect semnificativ al DIET în comparație cu controlul și există un efect semnificativ al probei (probele ulterioare au avut un număr mai mare).