abstract
Am raportat recent că acidul poli [α- (4-aminobutil) -L-glicolic biodegradabil (PAGA) poate condensa și proteja ADN-ul plasmidic de DNaza I. În acest studiu, am investigat dacă administrarea sistemică de pCAGGS la IL-10 murin (mIL -10) O plasmidă de expresie complexată cu PAGA poate reduce dezvoltarea insulitei la șoarecii diabetici neobezi (NOD). Complexele plasmatice PAGA/mIL-10 au fost stabile mai mult de 60 de minute, dar ADN-ul gol a fost distrus în decurs de 10 minute de DNaza I. Complexele PAGA/ADN au fost injectate în vena cozii șoarecilor NOD de 3 săptămâni. Nivelurile serice de mIL-10 au atins un maxim la 5 zile după injectare și au putut fi detectate mai mult de 9 săptămâni. Prevalența insulitei severe la șoarecii NOD în vârstă de 12 săptămâni a fost semnificativ redusă prin injectarea intravenoasă a complexului PAGA/ADN (15,7%) comparativ cu injectarea de ADN gol (34,5%) și martorii netratați (90,9%). În concluzie, administrarea sistemică a complexelor pCAGGS mIL-10 plasmidă/PAGA poate reduce severitatea insulitei la șoarecii NOD. Acest studiu arată că complexul PAGA/ADN are potențialul de a preveni diabetul zaharat autoimun.
O caracteristică patologică a diabetului de tip 1 este distrugerea autoimună mediată de celule a celulelor β insulite pancreatice (insulită). Un studiu recent a arătat că injecția intramusculară de plasmide citokinice imunosupresoare poate suprima în mod eficient progresia diabetului autoimun la un model animal de diabet de tip 1 (șoarece diabet non-obez, șoarece NOD).
Administrarea intravenoasă a plasmidei goale a fost exprimată în ficat, plămâni și splină. Cu toate acestea, ADN-ul plasmidic este îndepărtat rapid din circulație datorită absorbției sale hepatice extinse și degradării rapide de către nuclează plasmatică. 456 Deși s-a demonstrat că formarea complexă, în special cu lipozomi cationici, crește stabilitatea ADN și expresia genelor, plasmida este încă îndepărtată rapid din plasmă. circulația și complexele de lipozomi/plasmide sunt toxice pentru celule.78 Am sintetizat recent un polimer cationic biodegradabil, acid poli [α- (4-aminobutil) -L-glicolic)] (PAGA). Acest polimer condensează eficient ADN-ul și este mai puțin citotoxic decât PLL. PAGA este biodegradabil, netoxic pentru celule și crește transfecția în celule cultivate.9 Am folosit PAGA ca purtător de ADN pentru livrarea sistemică a IL-10 murin (mIL-10) și am investigat dacă acest sistem polimeric ar putea preveni insulita la șoarecii NOD . În acest studiu, am constatat că PAGA sintetic a crescut eficiența transfecției plasmidei pCAGGS mIL-10 in vitro. Complexele plasmatice PAGA/mIL-10 pot fi livrate în ficat după injecția intravenoasă, iar complexele pot suprima progresia insulitei autoimune la șoarecii NOD.
Rezultatul
Formularea și caracterizarea in vitro
A fost efectuat un studiu de întârziere a gelului pentru a confirma auto-asamblarea complexelor PAGA/plasmidă. Raporturile crescânde ale complexelor PAGA/plasmidă au fost identificate prin electroforeză pe gel de agaroză 1,0%. Rezultatele au arătat că PAGA a fost capabil să condenseze ADN-ul plasmidic în particule mici într-un raport de încărcare de 2: 1 (+/-) (Figura 1). Diametrul efectiv mediu al complexelor PAGA (2: 1, +/-), determinat prin împrăștierea luminii, a fost de 179 nm. Stabilitatea în prezența DNazei I este unul dintre parametrii de bază ai eliberării genice sistemice. Rezultatele testului de stabilitate DNase I sunt prezentate în Figura 2. Tot ADN-ul gol a fost distrus în decurs de 10 minute, dar PAGA protejează ADN-ul de DNaza I mai mult de 60 de minute.
Complexul PAGA/ADN a fost analizat prin electroforeză cu întârziere în gel de agaroză. Banda 1, raportul de încărcare PAGA/ADN 2: 1 (+/−); banda 2, 1: 1; banda 3, 1: 2, banda 4, 1: 3; banda 5, ADN gol. PAGA a reușit să capteze ADN într-un raport de încărcare 2: 1 (+/−).
Imagine la dimensiune completă
Scindarea complexelor PAGA/ADN prin digestia DNasei I. Complexele PAGA/ADN au fost preparate într-un raport de 2: 1 (+/-) și incubate la 37 ° C. Pentru a disocia ADN-ul plasmidic din PAGA, 37 μl de SDS 1,0% s-a adăugat și complexul a fost încălzit la 65 ° C peste noapte. ADN-ul a fost separat pe un gel de agaroză 1,0%. (a) ADN gol; (b) complex PAGA/ADN. PAGA a reușit să protejeze ADN-ul mai mult de 60 de minute.
Imagine la dimensiune completă
Transfecția in vitro
Am evaluat dacă PAGA are un efect îmbunătățit asupra livrării plasmidei către celule 293T (ATCC, Rockville, MD, SUA). Eficiența transfecției mediate de PAGA pe celule 293T a fost semnificativ mai mare decât cea a ADN-ului gol (P
Eficiența transfecției in vitro a ADN-ului complex PAGA/ADN în celule 293T (1 μg ADN per godeu, 2 x 104 celule per godeu). După 24 de ore de cultură, mediul de creștere a fost colectat și nivelul de mIL-10 a fost măsurat prin ELISA. Valorile indică media și abaterea standard.
Imagine la dimensiune completă
Detectarea RT-PCR a ARNm mIL-10 în ficatul șoarecilor NOD
Am determinat prezența ARNm mIL-10 transcris dintr-un complex PAGA/ADN injectat intravenos prin RT-PCR. Pentru a exclude produsele RT-PCR din plasmida pCAGGS contaminată sau ARNm mIL-10 endogen, primerii au fost proiectați pentru a include secvența intronică a plasmidei pCAGGS-mIL-10. Dimensiunea produsului RT-PCR dorit a fost de 222 perechi de baze. Ca rezultat, mIL-10 mARN a fost detectat în ficat după injecție intravenoasă atât în grupul gol cât și în grupul complex PAGA/ADN (Figura 4). Cu toate acestea, în ficatul grupului nud, expresia plasmidei mIL-10 a scăzut la 5 săptămâni după injectare, în timp ce grupul complex PAGA/ADN a prezentat un grad similar de expresie până la 9 săptămâni după injectare. Produsul RT-PCR al splinei și pancreasului nu a fost identificat.
RT-PCR a țesutului hepatic al șoarecilor NOD după injecții intravenoase de complexe PAGA/ADN (144 μg PAGA/100 μg ADN, 2: 1, +/-). Căile 1-5, grup injectat cu complex PAGA/ADN; benzi 6-10, grup încărcat cu ADN; banda M, marker molecular; grupul C, PAGA a injectat grupul. Benzi 1 și 6, la 1 săptămână după injectare; benzile 2 și 7, 2 săptămâni; benzile 3 și 8: 3 săptămâni; benzile 4 și 9, 5 săptămâni; benzile 5 și 10, 9 săptămâni.
Imagine la dimensiune completă
Expresia in vivo a mIL-10 și a insulitei
Am investigat dacă insulita șoarecilor NOD poate fi suprimată după injecțiile intravenoase ale complexului plasmidic PAGA/mIL-10. Șoareci femele NOD de trei săptămâni au fost injectați o dată cu 100 μg de plasmidă mIL-10 complexată cu PAGA (raportul de încărcare PAGA: ADN = 2: 1, 200 μl, pH 7, 35 soluție salină tamponată cu fosfat) în vena cozii. La orele programate, șoarecii NOD au fost sacrificați pentru a preleva probe de sânge și ficat. Nivelurile serice de șoarece de IL-10 au fost măsurate prin ELISA 1, 2, 3, 5 și 9 săptămâni după administrarea sistemică. Nivelurile serice mIL-10 NOD ale șoarecilor injectați cu complexul plasmidic PAGA/pCAGGS de șoarece IL-10 (grupul complex PAGA/ADN) au fost semnificativ crescute și expresia mIL-10 a fost menținută peste nivelurile de control timp de mai mult de 9 săptămâni (P
Concentrația serului de șoarece de IL-10. Fiecare șoarece NOD a primit o injecție intravenoasă de ADN sau complexe PAGA/ADN (2: 1, +/-, 100 μg ADN per șoarece) la vârsta de 3 săptămâni. Nivelurile serice de mIL-10 au fost măsurate prin ELISA la 1, 2, 3, 5 și 9 săptămâni. Niciun grup de injecție (martor) nu a fost examinat în ziua 0. Valorile indică media ± sem
Imagine la dimensiune completă
Suprimarea insulitei la șoareci NOD după injectarea complexelor PAGA/ADN (2/1, +/−) în vena cozii la o doză de 100 μg de plasmidă pCAGGS mIL-10 per șoarece. Insulita a fost evaluată prin colorarea a mai mult de 20 de insule din fiecare pancreas cu hematoxilină-eozină și evaluarea progresiei insulitei. a) grup injectat cu PAGA; (b) un grup injectat cu un complex PAGA/ADN; (c) un grup injectat cu ADN gol; (d) gradul de insulită 0; (e) insulita de gradul 2; și (f) insulită de gradul 4.
Imagine la dimensiune completă
discuţie
Diabetul zaharat autoimun este un candidat clar pentru terapia genică. În principiu, cel mai bun mod de a trata diabetul autoimun ar fi identificarea persoanelor cu risc și tratarea acestora pentru a preveni deteriorarea insulelor.
În terapia genică, principalele obstacole în tratamentul bolilor au fost expresia tranzitorie și eficiența scăzută a transfecției plasmidei. Injecțiile intravenoase repetate pot fi o soluție pentru a depăși aceste bariere majore. Studiile anterioare au constatat că nivelurile de expresie ale ADN-ului injectat intravenos nu erau detectabile.1011 Cu toate acestea, un studiu recent a arătat că nivelurile de expresie erau ridicate pentru injecția rapidă intravenoasă a volumelor mari de ADN gol.12 Livrarea intravenoasă de ADN gol rămâne o provocare. Protecția plasmidei împotriva degradării prin nuclează poate duce la o eficiență mai mare a transfecției
Livrarea cu succes a ADN-ului din citoplasmă către nucleu este importantă pentru dezvoltarea sistemelor de terapie genică. Polimerii cationici biodegradabili au fost introduși ca un sistem de livrare a genelor care poate îmbunătăți eficiența transfecției. Pot condensa ADN-ul și îl pot proteja de degradarea prin nuclează. Expresia plasmidică înaltă și de lungă durată a fost realizată cu un ester de carnitină biodegradabil după administrarea intravenoasă la șoareci.15
Un alt tip de sistem genetic biodegradabil sintetizat este lipidele cationice. Lipidele cationice au indus o expresie transgenică mai mare decât alți lipozomi, iar degradarea lor în celule a crescut ADN-ul fără celule intracelulare.16 Am constatat că complexele PAGA/ADN biodegradabile injectate intravenos au indus o expresie pe termen lung și lung la șoarecii NOD. Acest rezultat sugerează că degradarea PAGA poate crește ADN-ul fără celule intracelulare. Sunt necesare încă investigații suplimentare.
Eliberarea endozomilor și disocierea complexului cationic purtător/ADN înainte de transcriere sunt necesare pentru a îmbunătăți eficiența transfecției. Sarcina pozitivă excesivă poate fi un obstacol în disocierea complexului cationic purtător/ADN.
Studii recente au arătat că infiltrarea unei celule mononucleare autoreactive în insulițe (insulită) este cauzată de un dezechilibru al citokinelor secretate de celulele ajutătoare de tip ajutor 1 (Th1) și tip 2 (Th2). 1920 Citokinele pro-inflamatorii secretate de celule Th1 (IFN-γ și IL-2) cresc imunitatea inflamatorie și mediată celular, în timp ce citokinele anti-inflamatorii secretate de Th2 (IL-4, 5, 6, 10 și 13) stimulează imunitatea umorală . celulele mediază insulita autoimună. Activarea celulei Th1 la șoarecii NOD a fost suprimată de mIL-10, care poate preveni insulita și diabetul.232425 Această terapie recombinantă cu citokine a arătat biodisponibilitate scăzută, instabilitate chimică și un răspuns imun modulat. Prevenirea dezvoltării diabetului în NOD cu mIL-10 este dependentă de vârstă. Datele anterioare au arătat că este necesară injectarea la o vârstă fragedă.1 Prin urmare, am injectat complexul PAGA/ADN la șoareci NOD de 3 săptămâni pentru a preveni insulita. Plasmida pCAGGS nu provoacă inducerea nespecifică a nivelurilor IL-10.1
Pe scurt, polimerul cationic biodegradabil PAGA ar putea condensa plasmida IL-10 de șoarece pCAGGS, o poate proteja de DNaza I și ar putea crește eficiența transfecției în celulele 293T. Administrarea sistemică a pCAGGS mIL-10 plasmidă/complexe PAGA poate reduce severitatea insulitei la șoareci NOD. Aceste rezultate indică faptul că PAGA este un vehicul excelent de transfer de gene pentru injectarea intravenoasă a plasmidei mIL-10.
Materiale și metode
Sinteza PAGA
CBZ-L-oxilizina a fost sintetizată din CBZ-L-lizină prin diazotizare cu azotit de sodiu și acid sulfuric, urmată de extracție cu eter etilic și apoi precipitată cu kerosen. CBZ-L-oxilizina a fost polimerizată prin condensare la 150 ° C sub vid de 10 până la 4 Torr timp de 5 zile. Polimerul răcit a fost dizolvat în cloroform și precipitat cu metanol. Polimerul uscat a fost dizolvat cu DMF conținând un catalizator de paladiu pe carbon și s-a adăugat 85% acid formic ca donator de protoni. După 15 ore la temperatura camerei, soluția de polimer a fost izolată din catalizator prin filtrare. S-a adăugat HCI 2 N și polimerul a fost precipitat cu acetonă. PAGA a fost păstrat la -70 ° C până la utilizare.
Șoareci femele NOD de trei săptămâni au fost achiziționați de la Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, SUA) și menținuți în condiții specifice fără patogeni. Șoarecii NOD au fost sacrificați la ore programate prin luxație cervicală după anestezie prin inhalare cu metoxifluran (Schering-Plough Animal Health, Union, NJ, SUA).
Prepararea plasmidei pCAGGS mIL-10
Expresia de șoarece a ADN-ului plasmidic IL-10 pCAGGS a fost amplificată în eficiența subclonării DH5α a Escherichia coli (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, SUA) și a kiturilor maxime de plasmide Qiagen purificate (Qiagen, Valencia, CA, SUA). Puritatea și identitatea preparatului ADN plasmidic au fost confirmate prin măsurarea absorbanței la 260 nm și 280 nm și prin electroforeza cu gel enzimatic de restricție a plasmidelor digerate.
Prepararea complexului PAGA/ADN
Complexele PAGA/ADN au fost preparate intern. PAGA (1,5 mg) a fost dizolvat în 1 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS, pH 7, 3). O sută de microlitri de soluție PAGA au fost adăugați la 900 pl de PBS. Zece microlitri din soluția diluată de PAGA au fost adăugați încet prin picurare la 1 μl de plasmidă genică ADN preparată (1,0 mg/ml) și lăsați timp de 30 de minute (raport de încărcare PAGA/ADN 2: 1). Formarea complexului PAGA/ADN a fost monitorizată de rutină prin electroforeză pe gel de agaroză 1,0%. Dimensiunea particulelor complexului PAGA/ADN a fost determinată prin împrăștierea dinamică a luminii (BI-2030AT; Brookhaven Instruments, Holtsville, NY, SUA).
Stabilitatea complexelor PAGA/ADN
Raportul de încărcare (+/-) al complexului PAGA: ADN a fost de 2,0 în PBS. După formarea complexului, s-a adăugat DNase I (10 unități, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, SUA) la soluția complexă și suspensia complexă a fost incubată la 37 ° C timp de 60 de minute. O probă de 50 μl din suspensia complexă a fost prelevată la 0, 2, 5, 10, 20, 40 și 60 de minute după incubare, amestecată cu 75 μl de soluție stop (4 M acetat de amoniu, 20 mM EDTA și 2 mg/ml) . ml) și așezat pe gheață. Pentru a disocia ADN-ul plasmidic de PAGA, s-au adăugat 37 pl de SDS 1,0% și complexul a fost încălzit la 65 ° C peste noapte. După extracția cu fenol și cloroform, ADN-ul a fost precipitat cu etanol. Peletele s-au dizolvat în 10 pl de tampon TE și s-au aplicat la electroforeză pe gel de agaroză 1,0%.
Transfecția in vitro
Celulele NIH 293T (ATCC, Rockville, MD, SUA) au fost cultivate în plăci cu 24 de godeuri (Corning, NY, SUA) la o concentrație de 2 x 104 celule pe godeu timp de 24 de ore. Culturile au fost inițiate în DMEM (Gibco-BRL) conținând 10% ser fetal bovin suplimentat cu 100 U/ml penicilină la 37 ° C timp de 24 de ore cu 5% CO 2. Mediul de creștere a fost îndepărtat și celulele au fost spălate cu PBS. După adăugarea mediului de transfecție, celulele 293T au fost incubate timp de 24 de ore, apoi mediul a fost recoltat și depozitat la -70 ° C până când a fost utilizat pentru testul de expresie mIL-10.
Reacție în lanț a polimerazei cu transcripție inversă (RT-PCR)
ARN-ul total a fost izolat din ficatul de șoarece NOD la orele programate utilizând un sistem de cartuș de spin-izolație ARN GlassMAX (Life Technologies, Gaithersburg, MD, SUA). Transcrierea inversă a fost efectuată la 37 ° C timp de 1 oră folosind transcriptaza inversă (Qiagen) și un primer invers. Primerii oligonucleotidici specifici au fost primerul 5'-GCTGGTTATTGTGCTGTCTC-3 ', primerul 5'-CTCTAGGAGCATGTGGCTCT-3'. Acești primeri au fost concepuți pentru a include o secvență de introni, astfel încât să se poată distinge orice posibile produse PCR din ADN-ul plasmidic sau contaminarea ADN genomic.1 S-a utilizat următorul ciclu de reacție PCR: 40 cicluri la 94 ° C timp de 1 minut, 60 ° C timp de 1 min și 72 ° C 1 min 30 urmat de o extensie de 10 min la 72 ° C. Lungimea produselor așteptate a fost de 222 perechi de baze. Produsele PCR au fost analizate prin electroforeză pe geluri de agaroză 1,0% vizualizate prin colorare cu bromură de etidiu sub lumină UV.
Testul IL-10 de șoarece și măsurarea insulitei la șoareci NOD
analize statistice
Comparația concentrației IL-10 a fost efectuată prin testul t Student. O valoare P sub 0,05 a fost considerată semnificativă statistic.
Mulțumiri
Autorii mulțumesc Expression Genetics Inc. pentru sprijinul lor financiar și lui Jun-Ichi Miyazaki de la Universitatea din Osaka, Japonia pentru donația lor generoasă de plasmidă pCAGGS mIL-10. Dorim să îi mulțumim lui Troy Koch pentru asistență tehnică.