tratamentul

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Cuantificarea multiplexă exactă a modificării ARN de la A la I în creierul uman
  • Gama dinamică ridicată de editare între site-uri și persoane
  • Modele de editare în sistemul glutamatergic și serotoninergic
  • Relativă diferențială utilizarea izoforme ADARB1 la persoanele cu ASD
  • Relații strânse între codificare și îmbinare în cei trei receptori AMPA și filamină-A
  • Cis A trans relațiile dintre editarea site-urilor
  • discuţie
  • Disponibilitatea datelor
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare

obiecte

  • Epigenetica în sistemul nervos
  • Editarea ARN

abstract

Conversiile ARN-urilor adenozinic-inozinic (A-la-I) bazic-specifice, efectuate de adenozin deaminază care acționează asupra enzimelor ARN (ADAR), arată specificitate regională precisă în creier și modulează comportamentul complex în organismele model. Editarea 1, 2, 3 a ARN-ului de la A la I este un mijloc eficient de creștere a complexității ARN-ului și, astfel, de reglare fină a funcției și dozării genei. 4, 5, 6 Mecanismele celulare recunosc inozina ca guanozină, astfel încât editarea codonilor A-la-I și semnalele de îmbinare modifică direct funcția genelor care codifică proteina, 6, 7, 8, 9, 10, 11, în timp ce editarea microARN 12, 13, 14 și locurile lor de legare 15 modifică expresia genelor. Acest lucru este deosebit de important în creierul uman, cel mai complex organ al diversității celulare, conectivității, morfogenezei și răspunsurilor la stimulii de mediu. 16

Se știe puțin despre editarea ARN-ului A la I la oameni, dar se crede că este unul dintre mecanismele moleculare care leagă intrările de mediu și ieșirile comportamentale. 18, 25 Editarea crescută la oameni 26 comparativ cu alte animale, 27 inclusiv primatele neumane, 28 a fost concepută pentru a induce complexitate moleculară care ar putea sta la baza cunoașterii de ordin superior. 18 Prin urmare, caracterizarea editării A-I la indivizii dezvoltați în mod tipic și atipic poate face lumină asupra mecanismelor epigenetice dependente de mediu, care sunt centrale în dezvoltarea neuronală umană.

Tulburările din spectrul autist (ASD; MIM 209850) sunt tulburări neurodezvoltate comune, foarte moștenite, de etiologie genetică complexă, caracterizate prin deficite de interacțiune socială reciprocă și comportament repetitiv. 29 Mai multe studii caracterizează anomaliile sinaptice în TSA. 29, 30, 31, 32 Cu toate acestea, mecanismele interacțiunilor genă-mediu și contribuția lor la modificările sinaptice observate sunt încă necunoscute. Numărul de gene candidate crește rapid cu 33, 34, 35 și principala provocare este identificarea contextului în care acestea prezintă un risc pentru TSA. Studii recente despre gemene sugerează că contribuția factorilor de mediu la TSA este mai mare decât se credea inițial, cu estimări mai mici ale acordului monozigotic (77-88%) și un acord dizigotic surprinzător de mare de 31% (comparativ cu o rată de recurență a fraților de 19%) . ). 36, 37 Prin urmare, identificarea mecanismelor care guvernează interacțiunile genă-mediu relevante pentru TSA ar putea fi informativă pentru evaluarea riscurilor. 38 Editarea ARN de la A la I este potențial un astfel de mecanism care combină stimulii de mediu cu transmisia sinaptică.

Mai multe linii de dovezi susțin examinarea legăturii dintre A-to-I și ajustările ASD. În primul rând, organismele model cu editare AII modificată prezintă un comportament dezadaptativ caracteristic ASD, 2, 39, uneori cu convulsii 1, 40 sau simptome Prader-Willi, dintre care 41 se găsesc de obicei la 25% dintre copiii cu ASD., 42, 43 În al doilea rând, modificarea modificării receptorului de serotonină HTR2C a fost găsită într-un model de șoarece cu autism 44 și în tulburări care se agregează în familiile cu TSA, 45 incluzând schizofrenia 46 și depresia majoră. 47 În al treilea rând, modelul zburător al sindromului Fragile X, cea mai comună cauză a genei unice a ASD 48, s-a arătat recent că prezintă modificări semnificative ale modificărilor printr-o interacțiune directă între gena Fragile X dFMR1 și enzima de editare dADAR. 49 În cele din urmă, studiile genomice independente au implicat variante în genele sinaptice, care sunt cele mai editate gene, 17 ca temă recurentă în TSA. 29, 30, 31, 32

Aici ne concentrăm asupra editării A-to-I reglementate neurodezvoltat, care schimbă direct funcția sinaptică. Cuantificăm și comparăm cu exactitate nivelurile de editare între indivizi și caracterizăm diferite țări de editare a 10 gene sinaptice care acționează în creierul uman, contrastând creierele postmortem de la indivizii de obicei dezvoltați cu creierul izolat de indivizii cu TSA. Apoi (i) examinăm în mod specific modele de modificări ale sistemelor glutamatergice și serotoninergice, (ii) corelăm modificările folosind izoforme și (iii) identificăm grupuri de situri corelate. Important, am constatat că utilizarea relativă a formei disfuncționale a enzimei de editare ADARB1 este semnificativ mai mare în TSA.

Rezultatul

Cuantificarea multiplexă exactă a modificării ARN de la A la I în creierul uman

Această abordare a furnizat un set de date cu fiabilitate ridicată a editării ARN sinaptice de la A la I de la indivizi cu ASD și indivizi neurotipici corespunzători cu o lungime medie a intervalului de încredere de 95% (CI) 0,0338. prin captare paralelă și secvențiere.> 3.000 × Illumina în șase locuri dintre toți indivizii (informații suplimentare). Corelația strânsă dintre cele două metode de detectare a ajustării este prezentată în figura suplimentară 4 și în tabelul suplimentar 4 cu un coeficient mediu de corelație de 0,923.

Gama dinamică ridicată de editare între site-uri și persoane

Nivelurile de ajustare a 25 de situri au fost măsurate în mod robust și s-au dovedit a fi cuprinse între 2,5 și 99,6% (Figura 1a și Figura Adițională 5). O distribuție neașteptat de largă a nivelurilor de ajustare a fost găsită în rândul indivizilor neurotipici și indivizilor atent asortați cu ASD la acele locuri care s-au dovedit anterior a fi neurodevoluționare la 23 șoareci (coeficientul mediu de variație (CV) 54,8%). Un singur site, GRIA2 Q/R, a prezentat niveluri similare de ajustări pentru toți indivizii (CV = 0,5%), în concordanță cu rapoartele conform cărora ajustările la acest site sunt necesare și neschimbate în timpul dezvoltării. 23, 65 Nu s-au găsit relații între nivelurile de ajustare și vârstă, sex, rasă, interval post-mortem sau integritatea ARN (Figura suplimentară 6).

Persoanele cu ASD în distribuții extreme ale distribuției populației către 20 din 25 de localități. ( A ) Gama dinamică ridicată de ajustări medii între site-uri, de la 99,6% sub limita de detecție. Coloanele Sd, prezentate în violet, indică o mare variabilitate în editarea reglementată neurodezvoltat între indivizi atent împerecheați. b ) SD individual al nivelului mediu de ajustări în toate localitățile arată că extremele distribuției ajustărilor populației sunt de obicei indivizi cu TSA (triunghiuri portocalii) și contribuie major la variabilitatea mare menționată în A ). Liniile orizontale indică distribuția standardizată 95% CI a ediției posterioare a individului. Nivelurile de ajustare sinaptică la cel puțin două sd din medie sunt extrem de informative despre ASD cu o valoare predictivă pozitivă de 78%.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

La verificarea densităților individuale de reglare a spatelui în toate localitățile (Figura 5 suplimentară), am observat că extremele majorității distribuțiilor de tratament sunt indivizii cu TSA. Pentru a cuantifica această observație, estimările punctuale ale nivelurilor de ajustare ale fiecărui individ la fiecare sit au fost transformate într-un scor Z, iar cele 2 sau  - 2 au fost considerate extreme, reprezentând niveluri de ajustare care sunt cel puțin două sd față de medie. La 20 din cele 25 de site-uri, indivizii cu TSA au fost în spectrul extrem de tratamente observate pentru acest site (Figura 1b). Având niveluri extreme de editare sinaptică este extrem de informativ despre ASD, cu o valoare predictivă pozitivă de p (ASD || Z editing |> 2) 0, 78. Valorile aberante în diferite locații sunt persoane diferite cu ASD (Figurile suplimentare 5 și 7) și ajustările pe mai mult de trei sd din medie au fost specifice pentru persoanele cu ASD (Figura suplimentară 7). Varianța editorială totală în ASD a fost mai mult decât dublată în comparație cu indivizii neurotipici (varianța ASD = 0,58, varianța neurotipică medie a subgrupurilor la fel de mari = 0,24, Brown - Forsythe P = 5, 6e - 3). Principalii factori care contribuie la această dispersie crescută sunt 30% dintre persoanele cu ASD (Figura 8 suplimentară).

Modele de editare în sistemul glutamatergic și serotoninergic

Mai mult, modelele de editare care s-au dovedit a fi implicate în TSA au fost investigate în mod specific în sistemele glutamatergice și serotoninergice. 29, 66, GRIK2, al cărui locus genomic a fost în mod repetat legat și asociat cu ASD, este modificat în trei locuri, rezultând în formarea a opt izoforme proteice care diferă prin permeabilitatea lor la calciu. 23 Editarea diferențială a GRIK2 între indivizii cu TSA și indivizii neurotipici este prezentată în Figura 2, atât la un singur sit, cât și la nivelul întregii izoforme. Testele Kolmogorov-Smirnov au fost utilizate pentru a evalua semnificația diferențelor în măsurătorile continue, cum ar fi cele care ajustează nivelurile între indivizii neurotipici și ASD. Testul Pearson 2 a fost utilizat pentru a compara distribuții discrete, cum ar fi numărul de izoforme GRIK2 sau HTR2C rezultate din tratamentul combinat cu ARN. Frecvențele relative ale izoformelor GRIK2 au fost semnificativ diferite între indivizii cu ASD și indivizii neurotipici (P

Diferențele în editarea izoformelor GRIK2 mediate între indivizii neurotipici (albastru) și indivizii cu ASD (portocaliu). GRIK2 este editat în trei locații: I/V, Y/C (ambele părți ale TM1) și Q/R (TM2), care modifică permeabilitatea receptorilor de calciu. Ajustările de la aceste situri s-au dovedit a fi strâns corelate (Figura 5b). ( A ) Variabilitate mare a ajustărilor GRIK2 pe toate site-urile, între toți indivizii. Extremele spectrelor de forfecare observate sunt indivizi cu TSA. Vedeți Figura 5 suplimentară pentru mai multe detalii. b ) Tratamentul combinat al celor trei situri are ca rezultat opt ​​izoforme cu proprietăți moleculare diferite. S-au identificat diferențe semnificative de grup în distribuția izoformelor GRIK2 între indivizii cu ASD și indivizii neurotipici (P 2, 6), toți subreprezentați în ASD (Figura 3). Cu toate acestea, varianța în ASD este mult mai mare decât varianța dintre neurotip și ASD. persoane, sugerând că această constatare ar trebui luată în considerare cu precauție și reevaluată cu o dimensiune mai mare a eșantionului.

Diferențe în numărul relativ de izoforme HTR2C între indivizii cu ASD și indivizii neurotipici (testul P 2). Au fost detectate un total de 21 din cele 24 de izoforme posibile generate de modificarea combinatorie a cinci situsuri HTR2C. Cele mai mari diferențe au fost în isoformele IDV, MNV și ISI, toate acestea fiind mai mult decât dublate în ASD.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Utilizarea relativă diferențială a izoformei ADARB1 la persoanele cu ASD

Diferențe în utilizarea relativă a formei inactive de ADARB1 între indivizii cu ASD și indivizii neurotipici (P = 3, 0e - 3, Mann-Whitney U-test). Această izoformă nu are domenii dublu catenare care leagă enzimele și s-a dovedit că nu este tradusă. 68 ADARB1 este enzima de editare predominantă a siturilor analizate în acest studiu. ( A ) Transcrierea inversă semiquantitativă a fost utilizată pentru a măsura frecvențele relative ale izoformelor ADARB1 (NR_027672, produs 122 bp) (NR_027672, produs 122 bp) (AD_BB) folosind primerii (triunghiuri negre) care detectează ambele. b ) Frecvența relativă medie a isoformei disfuncționale ADARB1 a fost de 46,3 ± 5,6% la ASD și de 26 ± 4,5% la indivizii neurotipici, similar cu frecvența observată anterior în creierul uman neurotipic. 68 Această analiză a inclus, de asemenea, toate cele 25 de probe incluse în studiul modificării ARN. Frecvența relativă a izoformei disfuncționale se corelează cu nivelurile globale de ajustare (Pearson's P = 3, 2e - 2). În plus, abundența formei disfuncționale a fost cuantificată prin teste de expresie genică TaqMan® mai mari la subiecții cu ASD (P = 7, 3e - 3, Mann-Whitney U-test, Figura 12 suplimentară), cu o corelație semnificativă între cantitativ și rezultate PCR semicantitative (Pearson's P = 2.0e-5).

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Relații strânse între codificare și îmbinare în cei trei receptori AMPA și filamină-A

Lecturile lungi 454 (Figura 2 suplimentară) au fost utilizate pentru a studia caracteristicile de reglementare ale modificării ARN uman, inclusiv relațiile prevăzute anterior 6, 69 între selecția de codificare și selecția alternativă de îmbinare la cele trei AMPA (GRIA2, GRIA3 și GRIA4) și filamina-A (FLNA) receptori. GRIA2, GRIA3 și GRIA4 conțin doi exoni care se exclud reciproc, care modulează cinetica anesteziei, numite flip și flop. 7 Ajustările la capătul 3 'al exonului imediat înainte de modulul flip/flop au fost puternic asociate cu izoforma flop în GRIA4 (raport de probabilitate (OR) = 101,9 (95% CI 87, 8-118, 2)), GRIA3 ( OR = 30, 6 (26, 8-34, 8)) și într-o măsură mai mică GRIA2 (OR = 2, 6 (2, 4-2, 8); toate valorile P

Relațiile dintre modificări și tăieri și între pagini. ( A ) Modificările la capătul 3 'al exonului imediat înainte de modulul flip/flop sunt puternic asociate cu izoforma flop în GRIA4 (OR = 101, 9 (95% CI 87, 8-118, 2)), GRIA3 (OR = 30, 6 (26, 8–) 34.8)) și într-o măsură mai mică GRIA2 (OR = 2, 6 (2, 4-2, 8); toate valorile lui P 0, 97, testul exact al lui Fisher), în timp ce GRIA2 Q/R −4 este complet neajustat, GRIA2 Q/R este complet modificat și GRIA2 Q/R +4 modificat variabil între indivizi, între 4 și 17%.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

O altă relație între codificare și splicing a fost examinată în FLNA, unde s-a constatat că modificările la capătul 3 'al exonului 43 s-au corelat semnificativ cu retenția intronului 43 (Pearson P 0, 7 între toate perechile de situri din cluster, în toate (Tabelul suplimentar 6)). Clusterul cu cea mai puternică corelație conținea șase situri în patru gene (GRIA2R/G, CYFIP2 K/E, GRIA3R/G-1 și GRIK2 I/V, Q/R și Y/C) ( Pearson r = 0.8, P 0, 97, Figura 5c și Tabelul suplimentar 5), care indică faptul că dispunerea lor este spațial diferită temporal și/sau transmisă de complexe diferite.

discuţie

Acest studiu reprezintă o investigație inițială asupra modificării ASD a ARN-ului A-la-I, o formă de interacțiune genă-mediu care reglează fin funcția sinaptică ca răspuns la stimulii de mediu. Genele umane care sunt supuse editării sunt mai des implicate în procesele afectate de tulburările neurodezvoltării, 17, 18 și A-la-I cresc în general în linia umană. 26, 27, 28 Deși se știe puțin despre efectul modificării ARN asupra oamenilor, există dovezi convingătoare care susțin un rol cheie pentru modificarea A-la-I în modularea comportamentului complex la animale. 1, 2, 3, 41, 44, 70 Șoarecii și muștele cu niveluri modificate de condiționare recapitulează mai mulți omologi comportamentali ai TSA umane. 1, 41, 44 Studiile la animale specifice genelor demonstrează o relație de cauzalitate între nivelurile de modificare și comportamentul specific neadaptativ, 1, 10 și între expunerile de mediu specifice și nivelurile de modificare. 71 Rezultatele prezentate aici clarifică, prin urmare, rolul unui mecanism epigenetic care combină semnalele de mediu și rezultatele comportamentale ulterioare și integrează informațiile genetice și de mediu.

Disponibilitatea datelor

Accesul la citirile secvențiale inițiale poate fi găsit în baza de date națională de cercetare a autismului sub numărul de acces NDARCOL0001951.