ndufaf4

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Materiale și metode
  • Rezultatul
  • Raport de caz
  • Secvențierea exom totală identifică variante în NDUFAF4
  • Varianta NDUFAF4 duce la un deficit de CI izolat care poate fi salvat prin complementare lentivirală cu NDUFAF4 de tip sălbatic.
  • Deficitul CI în fibroblastele cu deficit de NDUFAF4 determină alterarea stoichiometriei supercomplexe
  • Deficiența NDUFAF4 duce la acumularea intermediarilor de asamblare CI care conțin componente ale modulului P proximal, modulului P distal și modulului N
  • discuţie
  • Informatii suplimentare
  • Documente Word
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Figura suplimentară 1
  • Figura 2 suplimentară
  • Figura 3 suplimentară

obiecte

  • Genetica bolilor
  • Tulburări metabolice

abstract

Complexul lanțului respirator mitocondrial I este format din 44 de subunități diferite și poate fi împărțit în trei module funcționale: modulul Q-, P- și N-modul. NDUFAF4 (C6ORF66) este un factor de asamblare I complex care este asociat cu intermediarii de asamblare a modulului Q. Prin secvențierea exomei, am identificat o variantă homozigotă de tip missense la un pacient complex cu deficit de I cu sindrom Leigh. Analiza supercomplexă a fibroblastelor pacientului a relevat stoichiometrie modificată în mod specific. O analiză detaliată a ansamblului complexului I, indicând toate căile sale de asamblare, a arătat acumularea de părți ale modulelor P și N, dar nu și modulului Q. Complementarea lentivirală a fibroblastelor pacienților cu NDUFAF4 de tip sălbatic a salvat deficiența complexului I și tulburarea de asamblare, confirmând rolul cauzal al variantei. Raportul nostru cu privire la a doua familie afectată de varianta NDUFAF4 caracterizează în continuare spectrul fenotipic și face lumină asupra rolului NDUFAF4 în biogeneza complexului mitocondrial I.

Lanțul respirator mitocondrial I (CI, NADH: ubiquinonă oxidoreductază) este cea mai mare componentă a sistemului de fosforilare oxidativă (OXPHOS). Este în formă de L și poate fi împărțit în trei module funcționale: modulul Q (reducere ubiquinonă) și modulul N (NADH dehidrogenază), care formează brațul matricei, și modulul P (pomparea protonului), care formează membrana- braț integrat.

Biogeneza CI este un proces complex: 37 de subunități codificate în nucleu și 7 subunități codificate în mitocondrie formează un număr de intermediari de asamblare care sunt asamblate în mai mulți pași paraleli și secvențiali pentru a forma un complex complet asamblat. Ulterior, CI este integrat în supercomplexe în care se asociază fie cu dimerul complex III (CIII) (supercomplexele I/III 2), fie cu dimerul CIII și una sau mai multe copii ale complexului IV (CIV, I/III 2/IV n - complexe de complexe). 1

Asamblarea CI depinde de acțiunea mai multor factori de asamblare care sunt asociați cu intermediarii de asamblare, dar care nu fac parte din holoenzima în sine.

NDUFAF4 (C6ORF66) a fost clasificat ca un factor de asamblare a modulului Q deoarece se asociază cu subansamble ale modulului Q în timpul biogenezei. 1 Cu toate acestea, funcția sa exactă nu a fost încă clarificată. Până în prezent, o variantă a NDUFAF4 a fost descrisă într-o familie care a afectat funcția proteinelor. 2 Aici prezentăm un pacient cu o nouă variantă de NDUFAF4, extindem fenotipul asociat cu deficiența NDUFAF4 și analizăm rolul acestuia în biogeneza KI.

Materiale și metode

Consultați informații suplimentare online.

Rezultatul

Raport de caz

Pacientul este primul copil al părinților supraviețuitori (veri primari) ai grupului etnic pakistanez. S-a născut la 38 de săptămâni de gestație după inducerea travaliului din cauza îngrijorărilor cu privire la întârzierea creșterii intrauterine. A cântărit 2406 g.

La vârsta de 7 luni, a fost introdus în serviciile locale de pediatrie pentru a-și reduce etapele. Zâmbea rareori, nu era în stare să se rostogolească, stătea nesuportat și nu zâmbea. Era un copil nedismorf, subponderal, cu iritabilitate. Avea hipotensiune centrală și un ton normal până la ușor ridicat al membrelor, cu reflexe ale genunchiului tendonului ușor evocate și fără clonă.

RMN cerebral a relevat modificări bilaterale difuze ale semnalului în ganglionii bazali și talamus, sugerând sindromul Leigh. EEG a arătat o încetinire generală cu vârfuri multifocale în concordanță cu țintirea epileptogenă. Nu au existat boli cardiovasculare, renale sau hepatice.

Analiza acizilor organici din urină a relevat creșterea metaboliților lactatului, cetonelor și ciclului Krebs. Lactatul plasmatic a fost de 10,6 mmol/l și lactatul CSF a fost de 6,1 mmol/l (interval de referință: 0,8-1,8 mmol/l). Fibroblastele cutanate derivate de pacienți au fost examinați pentru activitatea enzimei lanțului respirator care a prezentat un deficit de CI izolat (32 mU/U citrat sintază, interval de referință: 163-599) cu activitate a complexelor II, III, IV și V în intervalul de referință.

La doi ani de la examinarea inițială, pacientul are încă o întârziere profundă a dezvoltării, este necesară hrănirea tubului PEG și are crize episodice.

Secvențierea exom totală identifică variante în NDUFAF4

O variantă homozigotă de nerespectare a genei NDUFAF4 (NM_014165.3) a fost identificată prin secvențierea exom: c.7G> C; p. (Ala3Pro). Această variantă nu se găsește în baza de date ExAC (//exac.broadinstitute.org), în baza de date cu 1000 de genomi (//www.internationalgenome.org) sau în baza noastră de date internă. Noua variantă și varianta publicată anterior au fost încărcate în „Baza de date Leiden Open Variation” (//www.lovd.nl/NDUFAF4): ID-urile variantei # 0000170856 și # 0000174214; numerele de identificare individuale # 00104960 și # 00107834.

Software-ul de predicție variantă a prezis diferite efecte funcționale ale acestei mutații: Mutator de degustare (//www.mutationtaster.org/): 3 „polimorfism” (probabilitate: 0,84); PolyPhen-2 (//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/): 4 „probabil dăunător” (scor: 0, 991); SIFT (//sift.jcvi.org/): 5 „dăunător” (scor SIFT 0,04). Alinierea secvenței a arătat că alanina schimbată în poziția 3 a secvenței de aminoacizi este conservată la mamifere (Figura suplimentară 1).

Varianta NDUFAF4 duce la un deficit de CI izolat care poate fi salvat prin complementare lentivirală cu NDUFAF4 de tip sălbatic.

Complementarea lentivirală cu NDUFAF4 de tip sălbatic marcat cu C5-terminal a fost efectuată pentru a demonstra că varianta NDUFAF4 afectează funcția proteinelor (Figura 1). Activitatea enzimatică CI a fost salvată prin complementare cu NDUFAF4, dar nu prin transfecție simulată cu GFP marcat cu V5 (Figura 1a). Complementarea a salvat, de asemenea, niveluri reduse de holo-Cl, analizate prin electroforeză în gel de poliacrilamidă albastră nativă (BN-PAGE)/imunoblotare utilizând proteina mitocondrială 1-dodecil-β-D-maltozidă (Figura 1b). Nivelurile subunităților CI, analizate prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE), au crescut și în fibroblastele complementare ale pacientului (Figura 1c). NDUFAF4 nu a fost detectabil în celulele pacientului.

Imagine la dimensiune completă

Deficitul CI în fibroblastele cu deficit de NDUFAF4 cauzează stoichiometrie supercomplexă modificată

Deoarece CI formează supercomplexe cu CIII și CIV și nivelurile ultimelor două nu s-au schimbat în ciuda lipsei CI, am analizat stoichiometria supercomplexă. Pentru a păstra interacțiunile supercomplexe, proteina mitocondrială a fost solubilizată cu detergent ușor digitonină, mai degrabă decât n-ododecil-β-D-maltozidă și supusă BN-PAGE/imunoblotare. În cazul fibroblastelor cu deficit de NDUFAF4, absența CI a dus la o scădere a complexelor I-III 2- și I/III/IV n-super (Figura 2a-c) cu niveluri crescute de dimeri CIII și III 2/IV . -supercomplexe (Figurile 2b și c). În mod remarcabil, nivelurile de CIV monomerice au rămas neschimbate (Figura 2c).

Imagine la dimensiune completă

Deficiența NDUFAF4 duce la acumularea intermediarilor de asamblare CI care conțin componente ale modulului P proximal, modulului P distal și modulului N

Am analizat efectele deficienței NDUFAF4 asupra asamblării CI prin experimente 2D-BN-PAGE/SDS-PAGE în fibroblaste ale pacienților (Figura 3). În prima dimensiune a BN-PAGE, complexele proteice native (adică complexele OXPHOS) sunt separate (Figura 1b). Etapa SDS-PAGE a doua dimensiune permite separarea și disponibilitatea îmbunătățită a epitopului pentru imunodetecția componentelor individuale ale acestor complexe de proteine ​​native, inclusiv intermediarii ansamblului CI. În aceste experimente, am folosit anticorpi direcționați împotriva componentelor reprezentative ale intermediarilor asamblării tuturor modulelor funcționale și, astfel, împotriva tuturor căilor de asamblare CI (Figura 2 suplimentară). Subansamblurile modulului Q care conțin NDUFAF4 sau NDUFS3 nu mai erau detectabile în fibroblastele pacientului și nu se acumulau. Cu toate acestea, a existat o acumulare clară de subansamble proxime ale modulului P care conțin factori de asamblare ACAD9 și ECSIT, subansamble ale modulului P distal care conțin subunitatea CI NDUFB11 și subansamble ale modulului N care conțin subunitatea CI NDUFV2. Aceste defecte ale trusei au fost salvate în fibroblastele pacientului suplimentate cu NDUFAF4 de tip sălbatic.

Imagine la dimensiune completă

NDUFAF4 este strâns legat de NDUFAF3, 1, 6, un alt factor în asamblarea CI, a cărui lipsă duce la o eroare de asamblare similară. 7 Deoarece NDUFAF3 este considerat a fi implicat în inserția membranară a subunităților modulului β, 6 am analizat distribuția mai multor subunități CI în fracțiile de proteine ​​solubile mitocondriale și fracțiile de proteine ​​de membrană ale fibroblastelor pacienților (Figura suplimentară 3). La fibroblastele de control și la pacienți, subunitățile detectate ale modulului P au fost detectate în fracția membranei, dar nu și în fracția solubilă.

discuţie

Înainte de raportul nostru, o singură variantă de NDUFAF4 (c.194T> C; s. (Leu65Pro)) a fost raportată într-o familie cu mai mulți pacienți care au dezvoltat encefalopatie și acidoză lactică la scurt timp după naștere. Pacienții fie au murit în prima săptămână de viață din cauza acidozei incontrolabile, fie au dezvoltat miopatie severă, afectarea dezvoltării neurologice și acidoză metabolică recurentă. RMN-ul creierului unui pacient la vârsta de 16 luni a relevat atrofie generalizată severă și demielinizare a creierului. Pacienții care au supraviețuit perioadei neonatale au plecat la vârsta de 9 până la 18 luni din cauza acidozei instabile.

Pacientul descris în acest manuscris poartă o nouă variantă a NDUFAF4 missense și prezintă sindromul Leigh și întârzierea dezvoltării. Acest lucru evidențiază fenotipul neurologic cauzat de deficitul de NDUFAF4, adăugând sindromul Leigh, o boală mitocondrială definită, la spectrul său.

Deși deficiența complexului I poate fi însoțită de deficiențe ale altor complexe OXPHOS, 9 CIII și CIV sunt, în general, stabile în cazul deficienței complexului I. Cu toate acestea, distribuția lor în acest mediu nu a fost studiată la pacienții cu fibroblaste. Am arătat că speciile necomplexe CIII și CIV asociate cu I nu cresc în același mod, ci sunt modificate în mod specific atunci când formarea complexelor I-III- și I/III/IV n-helper este afectată.

Efectele variantelor NDUFAF4 asupra asamblării CI la fibroblastele pacienților nu au fost investigate. 2, 6, 11 Modelul nostru de asamblare CI umană detaliat recent publicat a arătat că procesul de asamblare CI reflectă arhitectura sa modulară: 1 subunități ale diferitelor module funcționale sunt asamblate separat și majoritatea asociațiilor intermodulare nu au loc până când nu sunt finalizați pașii biogenezei CI. NDUFAF4 este asociat cu intermediarii de asamblare a modulului Q. 1 Această asociație se formează în timpul asamblării timpurii a CI și persistă până la ultimii pași ai biogenezei, unde NDUFAF4 se disociază chiar înainte de finalizarea asamblării CI.

Experimentele de fracționare nu au evidențiat subunități ale modulului β în fracția solubilă și, prin urmare, nu există dovezi ale insuficienței inserției membranei în fibroblastele pacientului. Cu toate acestea, studiile anterioare au arătat că subunitatea ND1 β-modul se degradează mai rapid în absența NDUFAF4. 12 Astfel, acest mecanism nu poate fi complet exclus, deoarece este posibilă integrarea membranelor perturbate cu degradarea imediată imediată a subunităților.

Am arătat acumularea de părți ale tuturor modulelor, cu excepția modulului Q, cu care se conectează NDUFAF4. Acumularea modulelor N și P ar putea fi un efect secundar datorită asamblării limitate a modulului Q. Totuși, ar putea indica, de asemenea, că NDUFAF4 este necesar pentru a conecta componentele modulului P asamblate separat și ale modulului N la modulul Q. NDUFAF4 este cel mai probabil necesar pentru două etape de asamblare: (i) unirea subseturilor P P- b/P D- și Q/PP-a pentru a crea subsetul Q/P 1 și (ii) adăugarea unui modul N pentru a finaliza CI ( Figura suplimentară 2).

În concluzie, studiul nostru extinde spectrul fenotipic asociat cu deficiența NDUFAF4 și aruncă o lumină asupra rolului NDUFAF4 în compilarea CI. Studiile viitoare se vor concentra pe mecanismul molecular de acțiune al factorilor de asamblare.