Aberații semnificative genetic la pacienții cu sindrom mielodisplazic și metode de depistare a acestora

Abstract:

Sindromul mielodisplazic (MDS) este un grup eterogen de boli ale măduvei osoase hematopoietice clonale. Boala este definită de hematopoieza ineficientă, modificări displazice ale celulelor sanguine și prezența citopeniei în sângele periferic. Pacienții sunt de obicei mai în vârstă și aproximativ 30% din toți pacienții se transformă ulterior în leucemie mieloidă acută (LMA). Anomaliile cromozomiale clonale sunt detectate la aproximativ 50% dintre pacienții cu SMD primar și la mai mult de 80% dintre pacienții cu SMD secundar. Pe baza anomaliilor cromozomiale specifice, se poate prezice prognosticul pacientului, supraviețuirea generală și tratamentul adecvat. Am folosit analiza cariotipului citogenetic, hibridizarea fluorescenței in situ (FISH) și amplificarea sondei dependente de ligatura multiplexă (MLPA) pentru a examina pacienții și a dovedi aceste anomalii.

mielodisplazic

Cuvinte cheie: sindrom mielodisplazic, aberații cromozomiale, diagnostice

* Toate tabelele, graficele și cifrele care fac parte din articol pot fi găsite în fișierul PDF atașat la sfârșitul studiului.

Cauzele MDS

Dezvoltarea MDS este un proces în mai multe etape în care apar modificări ale materialului genetic al unei celule stem hematopoietice pluripotente. Este morfologic și funcțional diferit și dobândește un avantaj de creștere. Mecanismul patogenezei MDS nu este în prezent complet elucidat, se presupune că este implicată implicarea genelor care reglementează creșterea, diferențierea și moartea celulară. Celula modificată proliferează și treptat clonele înlocuiesc celulele stem sănătoase, atenuând sau oprind astfel hematopoieza normală (4). Distingem două tipuri de MDS - primar și secundar. Vorbim despre primar atunci când nu se cunoaște cauza bolii. Reprezintă 85% din totalul SMD și afectează în principal populația vârstnică cu o vârstă medie de 60-70 de ani. Incidența SMD primar a crescut în ultimii ani, datorită metodelor mai bune de diagnostic, îmbătrânirii populației și factorilor de mediu (5). Pentru MDS secundar (

15%) putem clarifica cauzele bolii. Pot exista mai multe, cum ar fi chimioterapia, radioterapia sau efectele toxinelor din mediu (6).

Prognosticul bolii

Cursul bolii este foarte variabil, de la cele mai ușoare forme cu o supraviețuire medie de câțiva ani la cele mai severe forme cu o supraviețuire mai mică de 5 luni (7). În ceea ce privește prognosticul, există mai multe sisteme de prognostic care clasifică pacienții în categorii de risc pe baza caracteristicilor conexe (8). În prezent este utilizat Revizuit Sistem internațional de notare a prognosticului - IPSS-R, care împarte pacienții în 5 categorii de risc în conformitate cu parametrii specifici care indică semnificația prognostică și în funcție de care se efectuează tratamentul. IPSS-R include i MDS Cysistem de notare togenetic (Tabelul 1), care determină grupul de prognostic al pacientului pe baza constatărilor citogenetice din cariotip (9).

Aberații cromozomiale

Aberațiile cromozomiale joacă un rol important în patogeneza, prognosticul și diagnosticul bolii. În SMD primar, acestea au fost raportate la 40-60% dintre pacienți. Pacienții cu SMD secundar au, de obicei, mai multe modificări ale genotipului, rearanjările cromozomiale fiind observate cu până la 80-90% (6). Un cariotip complex cu mai mult de trei aberații simultan este observat la aproximativ 15% din SMD de novo versus 50% în SMD secundar (10).

Cele mai frecvente modificări includ del (5q)/- 5, 01507/del (7q), +8, del (20q) A –A. Mai puțin frecvente, –17/del (17p)/i (17q), –18/del (18q), +21, +19, inv/t/del (3q), –13/del (13q), –21, t (5q), +11, + 1/+ 1q, del (12p), del (11q), t (7q), + mar și altele (7.11).

Conform schimbărilor actuale ale celulelor, putem presupune un prognostic al bolii. La pacienții cu un prognostic bun, găsim un cariotip normal sau doar modificări simple. Cursul bolii este ușor, durează cu o supraviețuire de câțiva ani și tratamentul este în mare parte simptomatic. Cu cât prognosticul este mai rău, cu atât este mai scurt timpul de supraviețuire al pacienților, diferitele modificări genetice sunt prezente și cu atât este mai mare probabilitatea transformării leucemice (12).

Metode de detectare a modificărilor genetice

1. Analiza citogenetică

Analiza citogenetică a cromozomilor este una dintre metodele de bază pentru detectarea aberațiilor. Permite monitorizarea reconstituirilor numerice și structurate ale cariotipului. Marele avantaj al metodei este abilitatea de a examina toți cromozomii într-o singură vedere. Dezavantajul este incapacitatea de a identifica modificările submicroscopice sub limita de detecție a metodei și, în același timp, nevoia de metafaze.

2. Metoda FISH

Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) este o metodă obișnuită în laboratoarele citogenetice și avantajele sale includ posibilitatea de a analiza celulele nu numai în metafază, ci și în interfază, când cultura celulară nu este necesară. Un alt avantaj este analiza rapidă a unui număr mare de celule. În același timp, face posibilă detectarea aberațiilor în aproximativ 15% din cazurile negative citogenetic și ajută la clarificarea reconstrucțiilor complexe. Un factor limitativ al metodei este posibilitatea de a identifica numai acele secțiuni de ADN în care sunt utilizate sonde. Pentru detectarea relevantă, cel puțin 1-5% din nucleele interfazice aberante ar trebui să fie prezente în probă.

tabelul 1. Sistemul de evaluare citogenetică MDS (9, modificat)

3. Analiza MLPA

La fel ca FISH, metoda de amplificare a sondei Multiplex ligatura dependentă (MLPA) utilizează legarea sondelor oligonucleotidice la o secvență ADN țintă pe baza complementarității lor. Spre deosebire de FISH, această metodă este capabilă să identifice mai mult de 40 de secvențe de ADN diferite într-o singură reacție (13). Sondele utilizate în metoda MLPA au o lungime mai mică (50 - 70 pb) și permit detectarea sensibilă a altor anomalii ale SMD relevante clinic cu o frecvență mai mică. Avantajul MLPA este diferențierea secvențelor care diferă între ele printr-o singură diferență de nucleotide. Un dezavantaj al tehnicii este necesitatea de a avea cel puțin 30% din celule mutante în eșantion pentru detectarea fiabilă a anomaliilor (14).

Scopul muncii noastre a fost:

  1. Creați și analizați un set de pacienți diagnosticați cu MDS examinați la departamentul nostru de genetică în perioada februarie 2016 - aprilie
  2. Determinați prezența aberațiilor cromozomiale, caracterizați-le, determinați incidența acestora în grup și împărțiți pacienții în funcție de aberațiile actuale.
  3. Evaluează relația dintre rezultatele testelor și prognostic.
  4. Pentru a determina contribuția metodelor individuale în evaluarea aberațiilor cromozomiale și pentru a compara succesul metodelor utilizate - citogenetica clasică, metoda și metoda FISH

Populația de pacienți și metode

Am înscris pacienți cu diagnostic de SMD care au fost examinați în laboratorul nostru de genetică din februarie 2016 până în aprilie 2018. Criteriul pentru înscrierea pacientului a fost diagnosticul pus de un medic la cerere. Am analizat un total de 620 de probe de pacienți, dintre care 383 au fost probe de măduvă osoasă (KD) și 237 au fost probe de sânge periferic (PK). În această lucrare am folosit următoarele metode: citogenetică, FISH și MLPA.

Preparatele de testare cariotip au fost preparate prin cultivarea celulelor KD în mediu complet timp de 24 de ore și procesate conform procedurilor standard. La 360 de pacienți, au fost analizate 20 de metafaze, dacă este posibil, și înregistrarea citogenetică a fost determinată în conformitate cu ISCN (International System of Chromosome Nomenclature). În metoda FISH, a fost utilizată ca material de pornire o KD cultivată și/sau PK a unui pacient preparat prin procesare directă. Ulterior, a avut loc hibridizarea cu sonda adecvată și evaluarea preparatelor sub microscopie cu fluorescență. Au fost evaluate un total de 521 de probe, 380 KD și 141 PK. Materialul de intrare pentru analiza MLPA a fost ADN izolat dintr-o probă KD și/sau PK furnizată în EDTA. Kitul SALSA MLPA P414-B1 MDS probemix (MRC - Holland) a fost utilizat pentru analize pentru a detecta 46 de regiuni cromozomiale specifice cu produse de amplificare de la 122 la 469 nucleotide. Sondele sunt proiectate pentru aberațiile cele mai frecvente și relevante din punct de vedere prognostic în MDS în conformitate cu IPSS-R. Această metodă a examinat 398 de pacienți (214 KD și 184 PK).

Rezultatele

1. Caracterizarea și analiza unui grup de pacienți

Setul include probe de măduvă osoasă sau sânge periferic de la 620 de pacienți și este format din 289 (46,6%) bărbați și 331 (53,4%) pacienți femei. Vârsta medie a pacienților la momentul diagnosticului a fost de 69 de ani, cu un interval de vârstă cuprins între 13 și 93 de ani. Pacienții examinați dintr-un eșantion de măduvă osoasă au prezentat patologii în 36% din cazuri, pacienții examinați dintr-un eșantion de sânge periferic în doar 14% din cazuri.

1. Incidența anomaliilor cromozomiale

Din rezultatele probelor de măduvă osoasă a 383 de pacienți, care au fost examinate citogenetic, de către FISH și/sau MLPA, am caracterizat și ulterior am determinat apariția celor mai frecvente anomalii. Am detectat un total de 287 aberații cromozomiale, cu cel puțin două metode utilizate pentru examinare la 99% dintre pacienți. Graficul prezintă reprezentarea individuală a aberațiilor ca anomalii izolate în genom și ca anomalii care au apărut în combinație cu alte patologii.

2. Determinarea prognosticului pacienților

Prognosticul și supraviețuirea mediană a 383 de pacienți au fost determinate folosind rezultatele testelor din analizele probelor de măduvă osoasă obținute prin citogenetică, FISH și/sau MLPA. Au fost evaluate reprezentarea pacienților individuali în grupurile de prognostic și supraviețuirea lor globală.

Am calculat supraviețuirea mediană prin metoda statistică Kaplan-Meier împreună pentru 351 de pacienți, de la care am avut informații disponibile despre supraviețuire, resp. moarte. Am determinat cu succes mediana în grupuri: medie, rea și foarte proastă. În grupurile foarte bune și bune, pacienții au avut o supraviețuire mai mare, iar prognosticul lor nu a redus probabilitatea de supraviețuire sub 0,5 (50%). Prin urmare, nu am obținut date relevante, deoarece o proporție mare de pacienți sunt încă în viață. Graficul demonstrează că, cu un prognostic mai prost, scade și supraviețuirea pacientului. ÎN în tabelul 3 este un rezumat al datelor din grupurile individuale de risc. Sunt arătate numărul pacienților din grupuri, numărul deceselor și al celor care trăiesc în grup și procentul de supraviețuire al grupului.

3. Determinarea succesului metodelor utilizate

80 de pacienți au fost examinați simultan prin toate cele trei metode. Acest fișier a fost folosit pentru a compara succesul metodelor utilizate. Am comparat numărul de analize reușite ale metodelor individuale, care au confirmat cel puțin o cronanaliză. S-a dovedit a fi cea mai sensibilă metodă de detectare a prezenței aberațiilor. Analiza cariotipului a fost pozitivă în 60 (75%) cazuri. Metoda de screening MLPA a demonstrat un succes comparabil cu analiza citogenetică. Ea a înregistrat o constatare pozitivă la 59 (74%) pacienți.

Discuţie

SMD este o boală a persoanelor în vârstă predominant cu o mediană de 70 de ani la momentul diagnosticului, grupul sub 50 este format din

10% dintre pacienți (2). În studiul nostru, vârsta medie a fost de 69 de ani, iar numărul pacienților sub 50 de ani a fost de 15%. Incidența SMD crește rapid odată cu vârsta peste 60 de ani. Greenberg și colab. (9) raportează că până la 77% dintre pacienți au vârsta peste 60 de ani la momentul diagnosticului. În activitatea noastră, pacienții cu vârsta peste 60 de ani au reprezentat 74%.

383 probe de măduvă osoasă și 237 probe de sânge periferic au fost utilizate pentru analize standard. Pacienții examinați dintr-o probă de măduvă osoasă au prezentat patologii în 138 (36%) cazuri, pacienții examinați dintr-o probă de sânge periferic doar în 34 (14%) cazuri. Detectarea patologiilor în măduva osoasă a pacienților a fost raportată în literatură în intervalul 37 - 55% (9,11,12). Ceilalți pacienți au avut o constatare negativă. Nu sunt disponibile studii pentru detectarea anomaliilor din sângele periferic integral. Pe baza rezultatelor noastre, putem afirma că măduva osoasă este un material biologic mai potrivit pentru analiză decât sângele periferic. Aici apare boala în sine, există o incidență mai mare a celulelor patologice și, astfel, o detectare mai mare a aberațiilor.

Motivul pentru care am obținut valori medii de supraviețuire mai mici și nu am obținut rezultate pentru grupurile cu un prognostic foarte bun și bun poate fi o perioadă scurtă de urmărire. Rezultatele noastre au confirmat că supraviețuirea generală a pacienților se scurtează pe măsură ce prognosticul se agravează.

De asemenea, am comparat succesul metodelor de diagnostic utilizate. Am evaluat un grup de pacienți care au fost examinați prin toate cele trei metode simultan. Pacienții nu au putut găsi o constatare negativă și metodele au trebuit să detecteze cel puțin o anomalie. S-a dovedit că metoda FISH este cea mai sensibilă pentru detectarea prezenței patologiilor. Ea a detectat cu succes patologia în 85% din cazuri. FISH are o sensibilitate și o specificitate ridicate pentru regiunea țintă din ADN. Detectează anomalii cu o rezoluție de la 100 kb la 1 Mb, dar surprinde doar regiunea cromozomului în care este utilizată sonda. Analiza cariotipului (75%) și metoda MLPA (74%) au arătat un succes comparabil. Analiza cariotipului surprinde aberații numerice și structurale pe toți cromozomii simultan până la o limită de detecție de aproximativ 5 Mb și este limitată de cultivarea nereușită a celulelor în mediu (20).

În același timp, metoda MLPA permite screeningul a 46 de zone specifice, care includ și anomalii ale SMD mai puțin frecvente. Cu toate acestea, limitarea sa este că nu poate capta rearanjări genetice echilibrate și are nevoie de cel puțin 25-30% din celulele afectate din eșantion (21).

Concluzie

Incidența SMD este în prezent în creștere în Europa și se așteaptă să crească cu 25.000 de cazuri noi în fiecare an. Motivul nu este doar îmbătrânirea populației, ci și creșterea poluării mediului. Prin urmare, diagnosticul corect al pacienților, determinarea corectă a prognosticului și stabilirea ulterioară a terapiei adecvate sunt foarte importante. Astăzi, metodele genetice standard sunt utilizate în diagnosticul aberațiilor, cum ar fi examinarea citogenetică a cariotipului, metoda FISH și analiza MLPA, fiecare dintre acestea având propriul său loc unic și combinația lor reciprocă garantează captarea a cât mai multe aberații în genom a unui pacient cu SMD.