- obiecte
- abstract
- introducere
- Materiale și metode
- fiară
- Injecție intra-VTA
- Aportul de alimente
- Activitatea locomotorie
- Funcționând receptiv
- electrofiziologie
- Sortarea fluorescentă a celulelor
- PCR cantitativă
- grunduri
- Implementarea FA în neuronii DA
- Analize statistice
- Rezultatul
- Oleatul intra-VTA inhibă aportul de alimente și stimulează activitatea locomotorie
- Oleate In-VTA suprimă alimentele
- Oleate modulează activitatea neuronală DA
- Proteine DA Neurons Express FA-Handling Proteins
- FA-urile sunt preluate de neuronii DA
- discuţie
- concluzie
- Finanțarea și divulgarea
- Informatii suplimentare
- Fișiere PDF
- Informatii suplimentare
obiecte
- Semnalizare celulară
- Acizi grași
- Comportamentul alimentar
- neurofiziologie
- Răsplată
abstract
Acizii grași cu lanț lung (FA) sunt semnale metabolice care sunt detectate central pentru a regla homeostazia energetică. Munca inițială a constatat că neuronii hipotalamici își modifică rata de tragere ca răspuns la FA (Oomura și colab., 1975), în timp ce studii recente au arătat efectul FA administrat central asupra suprimării hranei hepatice și a producției de glucoză (Lam și colab., 2005; Obici și colab., 2005;, 2002; Schwinkendorf și colab., 2011). S-a raportat că capacitatea FA de a inhiba consumul de alimente și de a modula funcția autonomă și neurotransmisia este mediată de transportul celular al FA și de metabolismul intracelular (Lam și colab., 2005; Le Foll și colab., 2013; Moulle și colab., 2013; Obici și colab., 2003). S-a demonstrat că blocarea hidrolizei FA din triacilglicerol în creier crește apetitul și creșterea în greutate (Cansell și colab., 2014; Picard și colab., 2014b).
Există unele dovezi care sugerează că efectul FA asupra metabolismului energetic depinde de structura chimică a lanțului FA. FA oleat monoinsaturat (OA) și palmitat FA saturat (PA) sunt cele mai abundente FA cu lanț lung în circulație și pot exercita diferite efecte de semnalizare și metabolice în creier. S-a demonstrat că OA, cel mai abundent FA din natură, reduce consumul de alimente atunci când este administrat acut în al treilea ventricul (Obici și colab., 2002; Schwinkendorf și colab., 2011) și inhibă sau excită neuronii hipotalamici (Jo și colab., 2009; Le Foll și colab., 2009; Wang și colab., 2006). În plus, am arătat că OA are o soartă metabolică intracelulară distinctă în celulele nervoase în comparație cu PA (Taib et al, 2013).
Materiale și metode
Experimentele au fost aprobate de Comitetul CRCHUM pentru bunăstarea animalelor, Comitetul pentru etica animalelor de la Universitatea de Montréal și Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale de la Facultatea de Medicină din New Jersey. Toate testele comportamentale au fost efectuate pe șobolani pentru a menține microinjecțiile precise VTA, în timp ce experimentele rămase au fost efectuate pe șoareci datorită disponibilității liniilor transgenice și a metodelor stabilite pentru culturile neuronale DA primare. Șobolanii masculi Wistar (Charles River, Saint-Constant, Quebec) cu o greutate de 250-280 g la sosire au fost adăpostiți cu 8-10 zile înainte de intervenția chirurgicală în camere cu ciclu invers (luminile stinse cu 1000 de ore). Șoareci masculi C57B1/6 (vârsta de 4-6 săptămâni) au fost folosiți pentru înregistrări electrofiziologice. Șoarecii transgenici TH-eGFP (fundal C57B1/6) care exprimă proteina fluorescentă verde (GFP) sub controlul promotorului tirozin hidroxilazei (TH) (Matsushita și colab., 2002) au fost folosiți pentru sortarea celulelor activate cu fluorescență (FACS). Culturile neuronale DA primare au fost derivate de la șoareci postnatali (P0 - P2) C57B1/6 (Fasano și colab., 2008).
Injecție intra-VTA
Chirurgia stereotaxică a fost efectuată sub anestezie cu izofluran și ghidată de coordonatele atlasului șobolanilor la șobolani (Paxinos și Watson, 1998). Șobolanii au fost implantați cu o canulă de ghidare pe două fețe (gabaritul 26, Plastics One) care se termină la 2 mm deasupra VTA (5,8 mm în spatele bregmei, ± 0,6 mm de la linia mediană și -6 mm de la dura). OA și PA (Na +; Sigma-Aldrich) au fost complexate cu hidroxipropil-β-ciclodextrină (HPB, CTD Holdings, Alachua, FL, SUA) și dizolvate în lichidul cefalorahidian artificial (aCSF, în mM: 125 NaCl, 2,5, 5 KCl, 0,3 KH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 10 glucoză, 1,3 MgS04 și 2,4 CaCl2; pH 7,4) până la o cantitate finală de 6 nmol pe fiecare parte. Doza de 6 nmol reprezintă 1/5 din doza utilizată în studiile anterioare de evaluare a hranei ca răspuns la a treia cameră OA și PA în complex cu HPB (30 nmol - Obici și colab., 2002; Schwinkendorf și colab., 2011). Deoarece am găsit un răspuns anorectic semnificativ la 60 nmol, dar nu și 30 nmol, infuzii de OA în ventriculul lateral (datele nu sunt prezentate), am folosit o diluție de 10: 1 a camerei parenchimului pentru a ajunge la o doză de 6 nmol intra-VTA. Floretina (EMD Millipore) a fost dizolvată în etanol 15% și diluată la 100 μM în aCSF. Substanțele au fost livrate într-un volum de 500 nl pe parte la o rată de 100 nl/min folosind o canulă interioară cu două fețe (Plastics One), care ieșea la 2 mm în spatele canulei de ghidare.
Aportul de alimente
Două cohorte de șobolani (total n = 41) au fost utilizate pentru a evalua efectul intra-VTA OA și PA asupra consumului de alimente. Șobolanii erau obișnuiți cu o dietă sub formă de pudră cu alimente timp de 4-7 zile. Alimentele au fost îndepărtate cu 3 ore înainte de injectarea OA sau vehicul sau PA sau vehicul, care a avut loc imediat înainte de începerea ciclului întunecat. Recipientele cu alimente umplute cu pudră de alimente au fost montate într-un recipient mai mare pentru a prinde deversările. Consumul de alimente și greutatea corporală au fost monitorizate la 2, 6, 12 și 21 de ore după injectare.
Activitatea locomotorie
Activitatea ambulatorie a fost evaluată în camere metabolice (AccuScan Instruments, Columbus, OH, SUA) în care șobolanii erau obișnuiți cu 24 de ore înainte de injectarea FA. Injecțiile au fost făcute chiar înainte de debutul fazei întunecate.
Funcționând receptiv
Un alt grup de șobolani (n = 10) cu canule VTA bilaterale a fost instruit să răspundă la 45 mg de pelete bogate în grăsimi și zaharoză bogată în zaharoză (TestDiet, Saint Louis, MO, SUA) pentru un raport de amplificare progresivă la șobolani cu camere de operare cu pârghii de ridicare (Med Associates, St. Albans, VT, SUA), așa cum s-a descris anterior (Sharma și colab., 2012). Odată ce s-a obținut un răspuns stabil la întrerupere, au fost evaluate efectele injecției în vehiculul intra-VTA, urmate de injecția OA în ziua următoare. După stabilizarea stabilizării perturbării (numărul randamentelor obținute nu s-a modificat cu mai mult de 15%), a fost evaluat răspunsul operatorului la aceleași animale ca răspuns la vehicul și apoi co-injectarea OA + floretină (100 μM în 0,5% etanol ). Testarea comportamentului a început la 1 oră după injectare, la începutul fazei întunecate. Localizarea canulei a fost verificată prin injecții de albastru de metilen (500 nl pe fiecare parte) după finalizarea experimentului.
electrofiziologie
Sortarea fluorescentă a celulelor
Șoarecii P0-P2 au fost crio-anesteziați și decapitați pentru colectarea țesuturilor. Așa cum s-a descris anterior (Fulton și colab., 2011; Mendez și colab., 2008), celulele proaspăt disociate au fost preparate din neuronii VTA și GFP pozitivi au fost purificați de FACS și colectați direct în Trizole (Qiagen, Toronto, ON, Canada).
PCR cantitativă
ARN total din microdisecții VTA și hipotalamus ventromedial (VMH) și celule sortate FACS a fost extras cu Trizol. Concentrația și puritatea ARN au fost evaluate sistematic. ARN-urile au fost transcrise invers în ADNc folosind transcriptaza inversă a virusului leucemiei murine Moloney (M-MLV RT, Life Technologies, Burlington, ON, SUA). Genele au fost amplificate folosind un kit PCR PCR Rotor-Gen SYBR Green PCR (Qiagen) în prezența perechilor de primer corespunzătoare. Rezultatele au fost normalizate la β-actină sau ciclofilină și analizate folosind o metodă de curbă standard (Taib et al, 2013).
grunduri
Primerii au fost proiectați utilizând BLAST (Biblioteca Națională de Medicină din SUA) și sintetizați prin Tehnologii ADN integrate pe baza următoarelor secvențe: actb (β-actină) înainte: 5-′TTCTTGGGTATGGAATCCTGTGGCA-3 ', invers: 5'-ACCAGACAGCACTGTGTTGGCATA-3'; cd36 înainte: 5'-TGCATGAATTAGTTGAACCAGGCCA-3 ', inversare: CCACAGTTCCGATCGCAGCC-3', ppia (ciclofilină) înainte: 5'-GCTTTTCGCCGCTTGCTGCA-3 ', inversare: TGCAAACAGCTCGAAGGC'AG fabp3 înainte: 5'-GATGACCGGAAGGTCAAGTC-3 ', invers: 5'-GCCATGAGTGAGAGTCAGGA-3'; fabp5 înainte: 5'-AAACCGAGAGCACAGTGAAGA-3 ', invers: 5'-AAGGTGCAGACCGTCTCAGT-3'; fabp7 înainte: 5'-AGTACATGAAGGCTCTGGGCGTG-3 ', invers: 5'-ATCACCACTTTGCCGCCTTCCT-3'; fatp1 înainte: 5'-GCAGGTACTACCGCATTGCT-3 ', înapoi: 5'-GAACTTCTTGCGCAGTACCA-3'; fatp4 înainte: 5'-TGTGGTGCACAGCAGGTATT-3 ', înapoi: 5'-TTTCCTGCTGAGTGGTAGAGG-3'; gad1 (GAD67) înainte: 5'-ATATCATTGGTTTAGCTGGTGAATG-3 ', înapoi: 5'-GTGACTGTGTTCTGAGGTGAAGAG-3'; înainte: 5'-CGACCCGTGGCCGGTCTAC-3 ', invers: 5'-GCAGTCTGGCTCGGGTGAGTG-3'.
Implementarea FA în neuronii DA
Neuronii midbrain DA crescuți pe stratul glial cortical au fost preparați de la șoareci de tip sălbatic P0-P2 așa cum este descris (Fasano și colab., 2008). Absorbția FA a fost evaluată folosind C1-BODIPY 500/510-C12, un analog fluorescent al FA care seamănă cu structura chimică a unui FA cu lanț lung cu un cap fluorofor (20 μM în 0,8% DMSO; ThermoFisher). La zece zile după inoculare, celulele au fost tratate cu BODIPY, BODIPY + floretină (100 μM în 0,5% etanol) sau vehicul singur în mediu de cultură (Neurobazal suplimentat cu glutamax) timp de 45 de minute. După trei spălări cu PBS răcit cu gheață, celulele au fost fixate cu 10% formalină timp de 10 minute. Imunofluorescența TH a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (Fulton și colab., 2011). Instrumentul analitic ImageJ (//imagej.nih.gov/ij/) a fost utilizat pentru a determina intensitatea fluorescenței BODIPY. Pentru fiecare condiție, densitatea integrată a fost măsurată în × 63 câmpuri mărite (n = 45) derivate din trei lamele individuale pentru fiecare condiție.
Analize statistice
Datele sunt prezentate ca medie ± SEM și au fost analizate folosind GraphPad Prism (versiunea 5.02 pentru Windows GraphPad Software, San Diego, CA, SUA). Analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) cu post-teste Bonferonni a fost utilizată pentru a analiza datele privind aportul alimentar și activitatea locomotorie. ANOVA unidirecțional a fost utilizat în electrofiziologie și imunofluorescență cu Bonferonni post-teste. Datele responsive ale operatorului și PCR cantitativă (qPCR) au fost analizate prin testul t Student. Semnificația statistică a fost stabilită la p = 0,05.
Rezultatul
Oleatul intra-VTA inhibă aportul de alimente și stimulează activitatea locomotorie
Am testat efectele acute ale OA intra-VTA și PA asupra consumului de alimente. Așa cum se arată în figurile 1a și b, OA a inhibat semnificativ aportul de alimente la 12 ore după injectare (vehicul: 23,9 ± 1,3 g, OA: 19,6 ± 1,6 g; scădere cu 18%; măsuri repetate ANOVA bidirecțională; F 1, 21 = 4, 47, p 0,05) sau locomoție (F 1, 16 = 0,07, p> 0,05; Figura 1c și d). Coordonatele bilaterale ale canulei VTA au fost confirmate prin injecții de microsfere de rodamină (Figura suplimentară S1A). Efectele anorectice ale OA sau PA nu au fost asociate cu inflamația locală, deoarece nivelurile de ARNm de IL-1 și TNFα în VTA nu s-au modificat după injectarea OA (OA: IL-1 p: t17 = 0,29; TNFα: t17 = 0,35 PA: IL - lp: t4 = 0,84, TNFα: t4 = 1,25, p> 0,05, imagine suplimentară S1B și C).
Oleatul intra-VTA inhibă aportul de alimente și stimulează activitatea locomotorie. a, b) Microinjecția bilaterală a OA (6 nmol/lateral) a redus aportul de alimente (a) și a crescut activitatea locomotorie (b). (c, d) Injecția de PA în VTA la o concentrație echivalentă nu a avut niciun efect asupra consumului de alimente (c) și a mișcării (d). n = 8-13/grup de evaluare a consumului de alimente; n = 7-10/grup pentru experimentul de activitate fizică. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Măsuri repetate duble ANOVA, * p 0, 05) sau pelete de reacție cu conținut ridicat de grăsimi/zahăr (figura suplimentară S3); t5 = 1,05, p> 0,05). Cu toate acestea, a împiedicat răspunsul punctului de întrerupere atenuat indus de OA (t6 = 0,31, p> 0,05; Figura 2b). Nu s-au observat modificări în raportul dintre depresiunile corecte și incorecte ale pârghiei (OA: t7 = 0,27; OA + floreton: t6 = 0,66, p> 0,05; Figura 2c și d). Evaluarea histologică ulterioară a relevat că canulele bilaterale au fost plasate în VTA la toți șobolanii (Figura 2e).
Oleate diminuează efectele benefice ale alimentelor bogate în grăsimi și zahăr. a) Injecția intra-VTA de OA a redus punctul de rupere care a răspuns la peletele bogate în grăsimi/zaharoză într-o sarcină chirurgicală cu raport progresiv. b) Co-injectarea unui blocant al transportorului de clorină a blocat efectul OA. (c, d) Niciunul dintre tratamentele nu a afectat procentul răspunsurilor corecte ale pârghiei. e) amplasarea canulei de injecție; fiecare simbol reprezintă un șobolan diferit (n = 7). Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. * p 0, 05).
Oleate modulează activitatea neuronală a dopaminei. a) Înregistrări ale activității electrice spontane a neuronilor VTA DA de la terminalele de curent celular. OA a scăzut frecvența potențială de acțiune (APF) a majorității neuronilor DA înregistrați. Administrarea concomitentă de floretină a împiedicat inhibarea APA indusă de OA. n = 6. b) Înregistrare reprezentativă. Potențialul membranei camerei este indicat printr-o linie întreruptă orizontală și este prezentat în stânga. (c, d) Înregistrări cu cleme de tensiune care arată că OA a scăzut amplitudinea (I mEPSC, c) și frecvența (d) a curenților miniaturali postsinaptici excitatori în neuronii inhibați de OA, efect care previne floretina. n = 7. e) Urme reprezentative. Deflexiunile descendente reprezintă mEPSC-uri. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Măsuri unidirecționale standard (a) sau repetate (c, d) ANOVA. * p # p ### p
Profilul expresiei genice a proteinelor manipulatoare ale acizilor grași din neuronii dopaminici și VTA. Neuronii DA (GFP +) și celulele non-DA (GFP-) au fost sortate după FACS de la șoareci TH-eGFP. Neuronii GFP + au fost dopaminergici, după cum reiese din nivelurile ridicate de ARNm TH și absența ARNm GAD67. Ciclofilina a servit ca genă de referință și toate rezultatele (cu excepția TH și GAD67) au fost normalizate la valorile obținute din țesutul VMH. FABP, proteină care leagă acidul gras; FATP, proteine pentru transportul acizilor grași; GAD67, glutamat decarboxilază; TH, tirozin hidroxilază.
Imagine la dimensiune completă
- Descărcați un diapozitiv PowerPoint
FA-urile sunt preluate de neuronii DA
Transportul intracelular al FA a fost evaluat folosind BODIPY, un analog fluorescent cu lanț lung al FA. Aplicarea BODIPY la neuronii DA primari a dus la marcarea la fața locului a neuronilor imunopozitivi TH (TH +), precum și la marcarea celulelor non-TH (Figura 5e, mărită la 5 ore). Imagistica optică Z și reconstrucția ortogonală au relevat marcarea celulară a unei forme sferice asemănătoare picăturilor de lipide din celulele TH + și procesele (Figura 5e și f). Mărimea încorporării BODIPY a fost redusă prin adăugarea de floretină la mediul de incubație (Figura 5f și g). Aplicarea BODIPY a crescut semnificativ intensitatea fluorescenței celulare (exprimată ca valoare integrată a densității) în comparație cu starea vehiculului, în timp ce administrarea concomitentă de floretină a atenuat intensitatea marcării fluorescenței în neuronii TH + (F 2, 44 = 502, 0, p = 0, 0001; Figura 5j).,
Aportul de acizi grași în neuronii dopaminari primari. Aplicarea lanțului lung FA BODIPY analog mediului de cultură a dus la punctuația intracelulară (verde) în citoplasmă, precum și la procesele DA ale neuronilor identificați prin imunofluorescență TH (roșu). (a, d, g) Utilizarea vehiculului. b, e, h) aplicarea BODIPY (20 μM). (c, f, i) Aplicarea BODIPY (20 μM) + floretină (100 μM). j) Valorile intensității fluorescenței BODIPY în condiții de tratament. Trei diapozitive de acoperire pentru o singură condiție. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. ANOVA cu sens unic. *** p ### p