obiecte

abstract

Factorii de transcripție homeotică florală (TF) acționează într-o manieră combinatorie pentru a determina identitățile organelor înflorite. Cu toate acestea, arhitectura și funcția rețelei de reglare a genelor (GRN) care reglementează specificația organelor florale este încă puțin înțeleasă. În special, interconectarea TF-urilor homeotice, a microARN-urilor (miARN) și a altor factori care controlează inițierea și creșterea organelor nu a fost investigată în mod sistematic. Aici, folosind o combinație de date de expresie de legare TF genomică, mARN și miARN, reconstituim GRN dinamic care reglementează dezvoltarea meristemelor florale și diferențierea organelor. Identificăm buclele predominante (FFL) mediate de TF homeotice florale și miARN care reglează țintele comune. Validarea experimentală a FFL coerent arată că dimensiunea ferestrei este controlată de modulul miR319/TCP4 reglementat de SEPALLATA3. Am demonstrat în continuare că legarea ADN combinatoriu la factorii homeotici și la alți TF selectați este un predictor al modelelor specifice de organ ale expresiei genelor. Rezultatele noastre oferă o resursă valoroasă pentru studiul proceselor de reglare moleculară care stau la baza specificării organelor florale din plante.

Creșterea și diferențierea organelor florilor este controlată în continuare de alte tipuri de TF, inclusiv BELLRINGER (BLR) 22, JAGGED (JAG) 23, ETTIN (ETT) 24, 25 și REPRESSORA GIBBERELLIC ACID (RGA) 26. BLR codifică homeodomeniul TF și joacă un rol central în dezvoltarea meristemului apical al activității apicale prin influențarea activității meristemelor, filotaxelor și modelelor florale ale organelor 22. JAG codifică un TF cu deget de zinc, care reglează formarea și creșterea limitelor organelor 27. ETT este un TF receptiv la auxină care reglează mai multe aspecte ale morfogenezei florilor 24, 25 și RGA controlează dezvoltarea inflorescenței prin participarea la calea de semnalizare a gibberelinului 26, 28 .

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) urmată de secvențierea ADN de mare viteză (ChIP-seq) facilitează identificarea regiunilor genomice legate de TF majore de dezvoltare în timpul dezvoltării florilor29. Biologii au început să înțeleagă tiparele de legare ale TF 30, 31 genomice și rețelele complexe de reglare a genelor (GRN) care controlează formarea florilor la scară globală 32. Cu toate acestea, o analiză sistematică a rețelelor genetice țintă ale acestor regulatori majori este încă insuficientă și, prin urmare, cunoștințele noastre despre componentele de rețea asociate care controlează dezvoltarea organelor florale sunt incomplete. În această privință, combinația de date de legare genomică și expresie oferă o oportunitate de a clarifica „codul” de reglementare care stă la baza specificațiilor florilor.

Mulți factori, cum ar fi microARN-urile (miARN-uri), joacă un rol în tranziția florilor și dezvoltarea florilor. De exemplu, tranziția dependentă de vârstă de la creșterea vegetativă la cea reproductivă s-a dovedit a fi reglementată de MIR156, care scade treptat odată cu vârsta, ducând la o expresie crescută a țintelor sale, TF SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), care la rândul lor sunt activatori ai genelor din amonte. Identități FM, LFY și AP1, precum și MIR172 (ref. 33, 34, 35). MIR172 vizează AP2 și paralogii săi strâns legați, controlând astfel tranziția florală și activarea specifică a genelor homeotice florale 16, 36. Alte rapoarte au arătat că MIR319 afectează dimensiunea petalelor prin reglementarea genelor TCP4 și TCP10 37. MIR159, MIR160, MIR164, MIR165, MIR166 și MIR167 joacă, de asemenea, un rol în morfogeneza organelor florale în Arabidopsis 38. În ciuda numeroaselor rapoarte despre miARN care reglează tranziția florilor și dezvoltarea florilor, este încă lipsită o înțelegere completă a controlului dinamic al acestor procese miARN. În special, avem cunoștințe limitate despre modul în care miARN-urile sunt reglementate de regulatorii de intrare.

În acest caz, am efectuat o analiză integrativă a datelor de legare a genomului pe tot genomul TF regulator principal, incluzând factori care controlează tranziția florii (FLC, FLM, SVP și SOC1), TF FM/identitatea organelor (LFY, AP1, AP2, AP3, PI, SEP3, AG) și regulatori ai morfogenezei organelor florale (BLR, JAG, ETT, RGA). Împreună cu noile date de ARNm și miARN specifice etapei, GRN-urile care controlează creșterea reproductivă în Arabidopsis au fost construite și examinate cu accent pe activitatea miARN în rețea. Am integrat toate informațiile de legare TF reglementate de miARN în rețeaua de reglementare a sistemului. Am efectuat o analiză a rețelei pentru a căuta în mod sistematic motive de rețea îmbogățite în această „meta-rețea” și a identifica buclele inverse predominante mediate de miARN (FFL). Am confirmat în continuare rolul important al FFL, care constă din MIR319a și obiectivele sale TF în medierea creșterii petalelor. În cele din urmă, am demonstrat folosind metoda învățării automate că legarea combinatorie de către regulatorii homeotici și alte TF-uri la gene țintă comune este importantă pentru activarea fazelor și organelor specifice activităților genetice.

Rezultatul

Teren de legare TF în timpul dezvoltării florilor

rețelelor

Imagine la dimensiune completă

În general, numărul siturilor de legare TF (TFBS; numite „vârfuri”) variază foarte mult pentru diferiți regulatori sau pentru același regulator în diferite etape (Fig. 1c; date suplimentare 2). BLR, LFY și SEP3 arată cel mai mare număr de site-uri de legare, ceea ce este în concordanță cu faptul că aceste TF au roluri multiple și diverse în dezvoltarea reproductivă 40, 41, 42. SEP3 dobândește situri de legare semnificative de-a lungul etapelor de dezvoltare a înfloririi, în concordanță cu rolurile sale în timpul dezvoltării organelor florale și cu nivelurile sale de expresie (Fig. 1c). Pe de altă parte, AP1 pierde site-uri de legare în cursul timpului de dezvoltare, ceea ce este în concordanță cu rolul său important ca factor de identitate FM în stadiile incipiente ale dezvoltării florilor și cu o exprimare mai limitată în momentele ulterioare (eficacitate redusă a ChIP).

Ocuparea mai multor TF prezice dinamica expresiei genelor

Pe scurt, genele legate de mai multe TF arată o expresie mai dinamică în timpul dezvoltării florilor. Diferite tipuri de gene reglatoare și un set definit de miARN sunt printre genele țintă țintă din rețeaua de dezvoltare a florilor.

GRN mediat de miARN și motive de rețea îmbogățite

Dintre țintele regulatorilor majori ai florilor, genele miARN au fost identificate frecvent (Fig. 1d) și adesea legate de TF multiple (Fig. 2e). Având în vedere că principala categorie de ținte miARN pentru plante este formată din TF 48 și aceste ținte pot fi, de asemenea, direct reglementate de regulatorii principali ai florilor, este atractiv să se elucideze GRN-urile de dezvoltare care sunt legate de TF regulatoare cheie florale, genele miARN și genele țintă ale acestora. Impactul diferitelor mecanisme de reglementare poate fi determinat dintr-o astfel de „meta-rețea”, iar miARN-urile care acționează ca jucători intermediari pot oferi straturi suplimentare de robustețe a rețelei 49. De fapt, există un total de 422 de relații de reglare TF-miARN preconizate și 273 de interacțiuni post-transcripționale miARN-TF între cei 15 regulatori majori, 144 de gene miARN exprimate și 674 de gene TF modificate în expresie (Fig. 3a). Analiza structurii rețelei silico a arătat că ștergerea genelor hub conduce la o pierdere mai rapidă a interacțiunilor în rețea fără reglarea miARN comparativ cu rețelele mediate de miARN (Fig. 3b). Această observație sugerează că reglarea mediată de miARN mărește robustețea topologică a 50 de GRN florale.

Imagine la dimensiune completă

Imagine la dimensiune completă

GRN specific organelor

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Morfogeneza florilor este un proces de dezvoltare a modelării extrem de robust și standardizat, care este inițiat de o combinație de căi de semnalizare de mediu și endogene. Deși s-a studiat bine că principalele TF de reglementare, care funcționează în diferite etape ale procesului de înflorire, formează bucle de reglementare complexe, interacțiunea lor de reglementare este mult mai puțin clară. În special, GRN-urile specifice pentru organe ale proteinelor homeotice florale au rămas misterioase, deoarece doar o mică parte din posibilele gene țintă directe ale acestor factori au fost identificate ca DE în dezvoltarea florilor. Aici, am arătat că combinația sistematică de 15 date de legare a ADN-ului TF cu roluri de reglementare în dezvoltarea florilor este capabilă să prezică gene care sunt reglate dinamic în timpul morfogenezei florilor. GRN rezultat este îmbogățit în regulatori transcripționali și loci miARN. Structura rețelei arată o supra-reprezentare specifică a motivului FFL bine studiat, care este mediat de activitatea combinată a TF și miARN.

Pe scurt, integrarea sistematică a datelor de legare a ADN-ului cu datele genomice de expresie a ARNm și miARN ne-a permis să identificăm proprietățile de reglare cheie în GRN care controlează etapele timpurii ale dezvoltării florilor, inclusiv specificațiile coajei florilor și diferențierea și creșterea organelor. De asemenea, am identificat un FFL nou care controlează creșterea petalelor în aval de proteinele homeotice florale și a evaluat rolurile de reglare combinatorie a genelor de către mai multe TF în determinarea modelelor de expresie genică specifice domeniului. Folosind aceste abordări de rețea, am identificat noi gene potențiale candidate care sunt responsabile pentru determinarea diferitelor morfologii și dimensiuni ale diferitelor tipuri de organe florale. Cercetările viitoare vor trebui să studieze în mod experimental funcțiile interacțiunilor specifice de reglementare, de ex. Folosirea mutagenezei direcționate la fața locului a regiunilor cis-reglatoare și TFBS.

metode

Materiale vegetale

PAP1: AP1-GR ap1 plantele de nămol au fost cultivate într-o cameră de creștere în condiții de zi lungă (16 h lumină, 8 h întuneric) cu o intensitate a luminii de 120 μmol/m 2/s, în timp ce temperatura s-a schimbat de la 22 ° C în timpul ziua la 20 ° C. ° C noaptea. Inflorescența a fost colectată de la plantele de nămol pAP1: AP1-GR ap1 după înșurubare (aproximativ 2 cm înălțime) și 2, 4 și 8 zile după primul tratament cu dexametazonă (tratament zilnic cu 2xM dexametazonă, 0,01% (v/v) etanol și 0,01% Silwet L-77) pentru analiza mARN-seq și miARN-seq.

Analiza datelor ARN-seq și ChIP-seq

Metodologia detaliată pentru analiza RNA-seq și ChIP-seq este dată în notele suplimentare 1 și 2.

Analiza miRNA și a altor expresii genetice

Metoda RT-qPCR buclă stem descrisă în Chen 76 a fost utilizată pentru a măsura expresia miARN cu puține modificări. În detaliu, ARN-ul total a fost extras cu Trizol (Thermo Fisher Scientific, SUA) și ARN-ul a fost eluat cu apă tratată cu DEPC plus 1 μl de inhibitor al ARNsei (Epicentru, SUA). Au fost utilizate trei sute de nanograme de ARN tratat cu DNază în combinație cu un primer stem-loop (100 μm), 10 mM dNTPs și apă fără ARNază/DNază într-un volum final de 13,5 μl pentru transcrierea buclei de tulpină. Amestecul de reacție a fost încălzit la 65 ° C timp de 5 minute și apoi răcit pe gheață timp de 1 minut. Enzima Super Script III (Thermo Fisher Scientific, SUA) a fost utilizată pentru a efectua transcrierea inversă. Pentru a detecta expresia genei mARN, ARN-ul total a fost extras cu trusa de ARN GenUP-Plant (Biozyme, SUA) și sinteza ADNc a fost efectuată utilizând M-MuLV Reverse Transcriptase (NEB, SUA). PCR cantitativă a fost realizată utilizând SsoAdvanced® Universal SYBR® Green Supermix (Biorad, SUA) utilizând sistemul de detectare PCR în timp real CFX96 Touch®. Secvențele de grund utilizate în acest document pot fi găsite în datele suplimentare 8.

Testul dual-luciferazei

Analiza rețelei

Pentru a evalua robustețea rețelelor care conțin miARN, am analizat și comparat structura rețelei a două tipuri de rețele: „meta-rețeaua” constând atât din reglarea TF-direcționată, cât și din reglarea mediată de miARN și rețeaua fără reglarea miARN. În principiu, o rețea mai robustă arată un grad mai mare de toleranță împotriva îndepărtării nodurilor. Am folosit funcția swan_combinatory în pachetul NetSwan din R pentru a calcula rezistența rețelelor datorită eliminării nodului, folosind un scenariu în cascadă pentru a elimina nodurile în ordinea descrescătoare a intervalului lor. Pierderea conectivității împreună cu fracțiunea de noduri eliminată a fost reprezentată grafic (Fig. 3b).

Apoi, am examinat în mod sistematic îmbogățirea motivelor din meta-rețea. Ne-am concentrat asupra analizei autoreglării (1 nod), a buclei de feedback (2 noduri) și a motivelor cu 3 noduri, care au implicații biologice deosebite 51. Motivele rețelei cu 1 și 2 noduri au fost căutate prin cod personalizat, în timp ce îmbogățirea motivelor cu 3 noduri a fost realizată de algoritmul FANMOD 54. Semnificația motivelor a fost determinată prin compararea numărului de motive observate cu numărul găsit în 1000 de rețele amestecate aleatoriu, așa cum a fost implementat în FANMOD. Pentru a determina dacă două ținte dintr-un SIM au posibile interacțiuni fizice, datele privind interacțiunea proteină - proteină (PPI) au fost obținute din ref. 79. Pentru fiecare regulator principal, a fost calculat procentul țintelor sale cu IPP potențiale în motivele SIM asociate. Ca un control, același număr de gene ca regulatorul principal investigat au fost eșantionate din întreaga listă de gene țintă pentru toți cei 15 regulatori master, iar o valoare procentuală similară a fost calculată ca mai sus. Ca rezultat, s-au obținut două seturi de valori procentuale (n = 15) și s-au comparat cu testul t Student (Fig. 3f).

Definirea genelor specifice domeniului

Datele translatome AP1-, AP3- și AG-domeniu (prin TRAP-seq) în etapele 4 (S4) și 6 (S6) au fost obținute din ref. 62. Genele exprimate specifice domeniului au fost determinate de ANOVA cu un efect de domeniu P-valoarea 2 dintre cele trei domenii la S4 sau S6. În total, au fost identificate 6072 de gene la acest pas, dintre care 2311 (38,1%) au fost legate de mai mult de unul dintre cele 11 TF selectate (inclusiv AG, AP1, AP2, AP3, BLR, PI, SEP3, LFY, JAG, ETT, și RGA) și utilizate pentru analize suplimentare. O genă a fost definită ca specifică AP1 (sepal) dacă a fost extrem de exprimată (mai mult de două ori schimbare) în domeniul AP1, dar nu în domeniile AP3 și AG. O regulă similară se aplică genelor specifice AG (carpel) sau genelor specifice AP3. Genele comune (petale) AP1/AP3 au fost definite dacă au prezentat o expresie ridicată atât în ​​domeniile AP1, cât și în domeniile AP3, dar nu în domeniul AG. În mod similar, au fost definite genele comune (stamen) AP3/AG. Ca rezultat, am identificat 1013 gene specifice organelor și 678 dintre ele au fost legate de mai mult de unul dintre cele 11 TF.

Modelarea contribuției de legare TF și expresia genei

Am adoptat un model bazat pe regresie pentru a relaționa dinamica expresiei genelor (678 gene specifice organelor așa cum s-a descris mai sus) și legarea TF (11 regulatori florali), așa cum a fost descris în studiile anterioare. În mod specific, am raportat schimbarea pliurilor (FC) a expresiei genelor între două organe la o combinație liniară a intensității de legare a 11 TF individuale și ne potrivim unui model log-liniar:

$$ \ log _2Y_i = \ mathop \ limits_ ^ \ beta _jx_ + \ varepsilon _i, $$

unde Y i este valoarea FC medie a genei i în S4 și S6 între două organe comparate. Scorul de legare TF x ij pentru TF j la gena i a fost definit scorul maxim normalizat. Datele legate de TF au fost normalizate și media centrate înainte de modelare. Regresia lazo a fost efectuată folosind pachetul glmnet în R pentru a calcula contribuția directă (adică parametrul β) al fiecărui TF la schimbarea expresiei. Modelul optim a fost ales prin cinci repetări de validare încrucișată de zece ori folosind pachetul de caret din R. Analiza de mai sus a fost efectuată prin intermediul aplicației Shiny HTPmod 80 .

Analiza statistică și vizualizarea datelor

Dacă nu este specificat, toate analizele statistice și vizualizarea datelor s-au făcut în analiza R. t-SNE (încorporarea stochastică vecină distribuită t) a fost efectuată de biblioteca Rtsne și rezultatul a fost vizualizat de instrumentul nostru online HTPmod 80 (//www.epiplant .hu-berlin.de/shiny/app/HTPmod /). Graficele stupului au fost generate folosind biblioteca HiveR. Vizualizarea rețelei a fost făcută folosind biblioteca igraph.

Disponibilitatea codului

Conducta de analiză a datelor ChIP-seq este adaptată de la //github.com/PlantENCODE/plantGRNs. Toate celelalte coduri personalizate ale computerului sunt disponibile de la autorii corespunzători, la cerere rezonabilă.

Disponibilitatea datelor

Toate datele care susțin rezultatele acestui studiu sunt disponibile în articolul sau în fișierele de informații suplimentare. Datele mRNA-seq și miRNA-seq au fost depuse la NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) sub numerele de acces GSE110539.

Mulțumiri

Dorim să mulțumim Johannei Müschner pentru asistența acordată cu ARN-seq și Lei Wang de la Universitatea Agricolă Huazhong pentru ajutorul cu experimentele genei reporterului luciferazei. Dorim să mulțumim Centrului pentru Tehnologia Informației și Managementul Media (ZIM) de la Universitatea Potsdam pentru furnizarea de resurse de calcul de înaltă performanță. KK dorește să mulțumească Fundației Alexander-von-Humboldt și Ministerului Federal al Educației și Cercetării pentru sprijin.