desaturază

  • abstract
  • Principalul
  • MATERIALE ȘI METODE
  • Tratamentul animalelor
  • Inducția CIH
  • Înlocuirea leptinei
  • Măsurarea alaninei aminotransferazei
  • histologie
  • TUNNEL de colorat
  • Vopsea roșie ulei
  • Analiza citokinelor plasmatice
  • Extracția ARN și transcrierea inversă
  • PCR în timp real
  • Analiza imunoblotului
  • Determinarea mobilității electroforetice
  • analize statistice
  • REZULTATELE
  • Tratamentul ConA crește acumularea de grăsime în ficat
  • Deficitul de SCD1 protejează șoarecii de CIH
  • Deficitul de SCD1 suprimă moleculele inflamatorii în patogeneza CIH
  • Deficitul de SCD1 suprimă căile de transcripție NF-kB B și STAT1
  • Nivelurile scăzute de leptină mediază rezistența CIH la șoarecii cu deficit de SCD1
  • DISCUŢIE

abstract

Imunitatea și metabolismul sunt strâns legate. Ficatul este un important organ metabolic din organism. Cu toate acestea, interacțiunile dintre hepatocite și sistemul imunitar sunt slab înțelese. La șoarecii care au dezvoltat hepatită indusă de concanavalină A (ConA) (CIH), am găsit o acumulare extinsă de lipide în hepatocite. O enzimă critică implicată în sinteza grăsimilor, cum ar fi stearoil-CoA desaturaza 1 (SCD1), a fost reglementată. Când am injectat ConCD la șoareci cu deficit de SCD1, am constatat că acești șoareci erau foarte rezistenți la CIH. Mecanismele efectului protector al deficitului de SCD1 pot fi atribuite nivelurilor reduse de leptină la acei șoareci care au modulat citokinele critice și căile de semnalizare în patogeneza CIH. În concluzie, studiul nostru sugerează că deficitul de SCD1 protejează șoarecii de leziunile hepatice dependente de leptină.

Principalul

Dovezile acumulate sugerează că metabolismul imunitar și cel energetic sunt strâns legate. Înfometarea și malnutriția pot suprima răspunsurile imune și pot crește susceptibilitatea la infecții, în timp ce obezitatea este asociată cu o stare de activitate imună aberantă și un risc crescut de boli inflamatorii. 1 Ficatul este cel mai mare și mai important organ metabolic din organism. Procesează principalele categorii de nutrienți după absorbția lor din tractul digestiv și stochează glicogen, grăsimi și vitamine. În ultimii ani, rolul ficatului ca principal organ imunitar a fost tot mai recunoscut. 2

Celulele imune, inclusiv celulele Kupffer și limfocitele, reprezintă aproximativ 45% din totalul celulelor nonhepatocite ale ficatului normal. 3 Aceste celule joacă un rol crucial în apărarea sistemului imunitar împotriva agenților patogeni invadatori. Șoarecii cu o steatoză hepatică indusă de o dietă bogată în grăsimi prezintă o proporție redusă de celule T killer naturale (celule NKT) în ficat și sunt susceptibili la afectarea ficatului indusă de lipopolizaharidă (LPS). 4, 5 În plus, la șoarecii hepatosteatotici care dezvoltă hepatită indusă de concanavalină A (ConA) (CIH), diferențierea celulelor T se deplasează semnificativ spre profilul Th1. În plus, la șoarecii hepatosteatotici au fost observate leziuni hepatice severe și producția mare de citokine pro-inflamatorii, inclusiv factorul de necroză tumorală α (TNF-α) și interferon-γ (IFN-γ). Prin urmare, s-au propus sindroame metabolice ca factori de risc pentru inflamația mediată imunitar și afectarea ficatului. Cu toate acestea, modul în care inflamația afectează metabolismul lipidic în ficat și interacțiunile dintre celulele imune și hepatocite sunt încă slab înțelese.

În studiul nostru privind CIH la șoareci, am observat o acumulare extinsă de lipide în hepatocite. Enzima critică implicată în sinteza grăsimilor, stearoil-CoA desaturaza 1 (SCD1), a fost reglementată semnificativ. În încercarea de a induce CIH la șoareci cu deficit de SCD1, am constatat că acești șoareci erau foarte rezistenți la CIH. Mecanismele care conduc la rezistența CIH la șoarecii cu deficit de SCD1 au fost apoi elucidate. Rezultatele noastre adaugă alte dovezi directe că hepatosteatoza afectează în mod semnificativ răspunsurile imune în ficat. Prin urmare, propunem să investigăm în continuare modularea metabolismului grăsimilor ca strategie potențială pentru intervenția și tratamentul bolilor inflamatorii hepatice.

MATERIALE ȘI METODE

Tratamentul animalelor

Șoareci masculi C57BL/6 cu vârsta cuprinsă între 8 și 10 săptămâni au fost achiziționați de la Shanghai SLAC Laboratory Animal CO LTD (Shanghai, China). Șoarecii Ab Xyk (încrucișați la șoareci Balb/c, generația F2) cu disfuncție spontană SCD1 au fost descriși anterior. Șoarecii au fost adăpostiți în facilități pentru animale la Institutul de Științe Biologice din Shanghai, Academia Chineză de Științe, în condiții fără patogeni, în conformitate cu liniile directoare ale Comitetului pentru îngrijirea și utilizarea instituțională a animalelor. Șoarecii au fost hrăniți ad libitum cu o dietă standard de laborator pentru hrana animalelor furnizată de SLAC Laboratory Animal CO LTD.

Inducția CIH

Șoarecii au fost injectați cu o singură venă (15 mg/kg greutate corporală) de venă coadă ConA pentru a crea un model CIH.

Înlocuirea leptinei

Șoarecii Ab Xyk/ab Xyk au primit 1 mg/kg leptină recombinantă de șoarece (R&D Systems, MN, SUA) sau PBS prin injecție intraperitoneală de două ori pe zi timp de 5 zile. Ulterior, ConA a fost injectat la toți șoarecii.

Măsurarea alaninei aminotransferazei

Plasma a fost obținută la aproximativ 17 ore după injectarea ConA. Nivelurile de alanină aminotransferază (ALT) au fost determinate folosind un kit de detectare ALT (Shanghai Yihua Medical Science & Technology, Shanghai, China) conform instrucțiunilor producătorului.

histologie

Ficatele au fost îndepărtate după perfuzie cu PBS, fixate cu paraformaldehidă tamponată cu fosfat 4% și încorporate în parafină. Secțiunile de țesut (5 μm) au fost preparate, colorate cu hematoxilină și eozină (H&E) și examinate prin microscopie cu lumină. Un total de 10 secțiuni de țesut au fost analizate pentru fiecare animal.

TUNNEL de colorat

Fragmentarea ADN-ului a fost analizată în țesuturile hepatice încorporate în parafină utilizând o reacție terminală de etichetare a nichelului dUTP-biotină nichel (TUNEL) mediat de deoxinucleotidiltransferază (TUNEL) conform instrucțiunilor producătorului (Roche Molecular Biochemicals, IN, SUA). Secțiunile au fost apoi examinate prin microscopie cu lumină. Un total de 10 secțiuni de țesut au fost analizate pentru fiecare animal.

Vopsea roșie ulei

Secțiunile de ficat înghețate (8 μm) au fost colorate cu Oil Red O (Sigma, MO, SUA) timp de 10 minute și apoi contracolorate cu hematoxilină timp de 45 s. Secțiunile au fost apoi examinate prin microscopie cu lumină. Un total de 10 secțiuni de țesut au fost analizate pentru fiecare animal.

Analiza citokinelor plasmatice

Concentrațiile plasmatice de TNF-α, IFN-γ și leptină au fost determinate folosind seturi de teste imunosorbente specifice legate de enzime (sisteme R&D) conform instrucțiunilor producătorului.

Extracția ARN și transcrierea inversă

ARN-ul total a fost izolat din peletele celulare și țesuturile hepatice folosind RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germania). ADN-ul genomic a fost îndepărtat din ARN-ul total înainte de sinteza ADNc folosind un kit de DNază fără RNază pentru scindarea DNazei în timpul purificării ARN-ului (Qiagen). ARN-ul a fost stocat la -80 ° C. Prima sinteză de ADNc de catenă a fost efectuată pentru fiecare probă de ARN folosind un kit Sensiscript RT (Qiagen). Au fost folosiți hexameri aleatori pentru a prepara sinteza ADNc.

PCR în timp real

S-a efectuat expresia genetică a oxidului nitric sintază inductibilă (iNOS), proteinei induse de interferon 10 (IP-10), proteinei chemotactice monocite-1 (MCP-1), proteinei inflamatorii macrofage-1a (MIP-1a), SCD1 și ARNm de leptină prin PCR în timp real utilizând mixul master SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Condițiile termociclatorului au inclus o perioadă inițială de menținere la 50 ° C timp de 2 minute, apoi la 95 ° C timp de 10 minute. Acesta a fost urmat de un program PCR în doi pași constând din 95 ° C timp de 15 s și 60 ° C timp de 60 s timp de 40 de cicluri. Datele au fost colectate și analizate cantitativ folosind un sistem de detectare a secvenței ABI Prism 7900 (Applied Biosystems). Β-actina a fost utilizată ca un control endogen pentru a normaliza diferențele în cantitatea de ARN total din fiecare probă. Toate cantitățile au fost exprimate ca multipli față de expresia β-actinei. β-actină:

Analiza imunoblotului

Analiza imunoblot a fost efectuată folosind probe de extract de celule hepatice întregi separate prin electroforeză pe un gel SDS-poliacrilamidă 10% și transferate la o membrană PVDF. STAT1, phospho-STAT1 (Thr-701), STAT3 și phospho-STAT3 (Tyr-705) au fost vizualizate folosind un anticorp de la BD Bioscience (CA, SUA).

Determinarea mobilității electroforetice

Extractele de ficat din țesuturile hepatice au fost preparate așa cum s-a descris mai sus. Oligonucleotida monocatenară consens de legare 8 NF-κB (5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3 ') a fost hibridizată mai întâi cu o oligonucleotidă complement (5'-GCCTGGGAAAGTCCCTCAACT-3'). Fragmentul de ADN recocit a fost marcat cu [y-32 P] dATP (Amersham, Piscataway, NJ, SUA) folosind polinucleotid kinaza T4 (Promega, Madison, WI, SUA). Proteinele nucleare (15 μg) au fost incubate cu sonde oligonucleotidice dublu catenare marcate cu 2,5 ng32P timp de 30 de minute la temperatura camerei. Amestecul a fost separat prin electroforeză pe geluri de poliacrilamidă 4% cu 0,5 x tampon de acid Tris-borat-etilendiaminetetraacetic la 4 ° C.

analize statistice

Toate rezultatele au fost exprimate ca medie ± sd. Comparațiile statistice între cele două grupuri au fost efectuate folosind testul t Student după analiza varianței. Nivelul de semnificație a fost stabilit la a = 0,05. Toate testele au fost pe două fețe.

REZULTATELE

Tratamentul ConA crește acumularea de grăsime în ficat

CIH este un model animal utilizat pe scară largă de leziuni hepatice mediate de imunitate și poate fi indus prin injecție intravenoasă de ConA la șoareci. Am constatat că acumularea de grăsime în hepatocite a fost observată încă la 2 ore după injectarea ConA, după cum se arată prin colorarea cu ulei roșu O (Figura 1a). Între timp, enzima critică implicată în sinteza grăsimilor, SCD1, a fost reglată (Figura 1b). De asemenea, am constatat că alte gene cheie lipogene, inclusiv acidul gras sintază, acetil-CoA carboxilaza 1 și Elov16, au prezentat un model de expresie similar cu SCD1 (Figura 1b). Astfel, în faza inițială a inducției CIH, coroborată cu dezvoltarea răspunsurilor imune care dăunează țesuturilor, s-a produs sinteza și acumularea de grăsimi.

Acumularea de lipide în CIH. Patru grupuri de șoareci C57BL/6 (n = 5) au primit o injecție de ConA (15 mg/kg) prin vena cozii. A ) Sunt prezentate fotomicrografii reprezentative care prezintă colorarea secțiunilor hepatice cu roșu ulei. Creșterea grăsimii (roșu) în hepatocite la 2 - 24 de ore după injecția ConA comparativ cu odihna (0 ore). ( b ) Exprimarea SCD1, FAS, ACC1 și Elov16 în ARNm hepatic. Rezultatele sunt raportate ca medie ± sd. Datele sunt reprezentative pentru cinci experimente.

Imagine la dimensiune completă

Deficitul de SCD1 protejează șoarecii de CIH

SCD1 joacă un rol cheie în metabolismul lipidelor. 9, 10 șoareci cu deficit de SCD1 prezintă sinteza deficitară a colesterolului și a trigliceridelor în ficat, 11, 12, prezentând astfel steatoză hepatică redusă. Șoarecii Ab Xyk 7 sunt șoareci nou caracterizați cu asbiu cu disfuncție spontană a mutației genei SCD1. Am folosit acești șoareci pentru a induce CIH. Laptele lor cu fenotip normal (șoareci Xyk +/+ sau +/ab, arătați ca +/a) au fost folosite ca martori.

La patru ore după inducerea CIH, s-a observat hepatosteatoză semnificativ mai mică la șoarecii ab Xyk/ab Xyk comparativ cu + /? șoareci (Figura 2a). Serul a fost colectat la 17 ore după administrarea ConA pentru măsurători ALT pentru a verifica severitatea leziunilor hepatice. Am constatat că ALT seric a crescut dramatic după inducerea CIH în +/-? șoareci (9183 ± 1629, U/L), indicând leziuni hepatice severe la acești șoareci. Cu toate acestea, la șoarecii ab Xyk/ab Xyk, creșterea ALT serică indusă de ConA a fost semnificativ blocată (88 ± 50, U/L; P la șoarecii ab Xyk/ab Xyk, au fost observate doar câteva leziuni inflamatorii sau necrotice (Figura 2c ad). Șoarecii cu deficit de SCD1 păreau a fi foarte rezistenți la CIH.

Șoarecii cu deficit de SCD1 sunt rezistenți la hepatita indusă de ConA. Șoarecii cu deficit de SCD1 (ab Xyk/ab Xyk) și șoarecii martor din așternut (+/a) (n = 5) au primit o injecție de ConA (15 mg/kg) prin vena cozii. Roșu ulei O colorare a părților ficatului la 4 ore după injectarea ConA ( A ). La șaptesprezece ore după injectarea ConA, s-a obținut plasmă și s-au măsurat nivelurile de ALT ( b ). În același timp, ficatul a fost îndepărtat și fixat în paraformaldehidă 4%. S-a efectuat colorarea ficatului H&E ( c ) și TUNEL ( d ) și rezultatele au fost examinate prin microscopie cu lumină (mărire × 200). Rezultatele sunt raportate ca medie ± sd. Datele sunt reprezentative pentru cinci experimente. ** P Xyk/ab Xyk foarte slăbit (Figura 3a și b). De asemenea, a fost investigată expresia mai multor mediatori inflamatori majori, inclusiv iNOS, IP-10, MCP-1, MIP-1α, despre care se spune că sunt importante în patogeneza CIH. Expresia tuturor acestor mediatori inflamatori s-a dovedit a fi semnificativ mai mică la șoarecii ab Xyk/ab Xyk decât la +/a. șoareci după inducția CIH (Figura 3c-f).

Împreună cu acumularea de lipide, am găsit o expresie crescută a SCD1 în ficatul șoarecilor CIH. SCD1 este o enzimă lipogenică centrală care transformă acizii grași saturați cu lanț lung în acizi grași mononesaturați (MUFA). Apoi am întrebat cum s-ar manifesta CIH la șoarecii cu deficit de SCD1. Așa cum era de așteptat, șoarecii cu deficit de SCD1 au fost foarte rezistenți la CIH, după cum se arată prin măsurarea ALT serică și examinarea histologică a ficatului. Deși un raport recent publicat a arătat că șoarecii cu deficit de SCD1 au prezentat o severitate crescută într-un model de colită acută indusă de sulfatul de dextran de sodiu. Efectul deficitului de SCD1 asupra leziunilor hepatice mediate de imunitate nu a fost cunoscut. Rezultatele noastre sugerează că SCD1, o enzimă cheie implicată în metabolismul grăsimilor, este implicată în afectarea hepatică mediată de imunitate. Apoi am continuat să explorăm mecanismul de bază.

Ne întrebăm cum SCD1, o enzimă pentru biosinteza MUFA, poate interfera cu inflamația. Am remarcat un raport de la Ntambi și colab. Că producția de leptină a fost suprimată la șoarecii cu deficit de SCD1 din diete și diete bogate în grăsimi. 14 Leptina este cunoscută ca fiind o legătură critică între metabolismul energetic și imunitate. Leptina afectează multe căi imune într-un mod direct sau indirect. Celulele imune patogene cheie din CIH, cum ar fi celulele T și celulele NKT, pot fi activate de leptină. Leptina promovează, de asemenea, producția de citokine pro-inflamatorii, cum ar fi TNF-α și IFN-γ, care sunt cruciale în patogeneza CIH. 13, 38 Un studiu anterior a arătat că sensibilitatea la CIH poate fi crescută de leptină prin menținerea unui număr mare de celule NKT hepatice, precum și prin medierea activării celulelor T și a producției de citokine. Prin urmare, obezitatea și sindromul metabolic ar expune ficatul la un risc crescut de afectare imun-mediată de un mecanism dependent de leptină. 39 Deficitul de leptină reduce severitatea modelului CIH. Aici, am observat scăderea nivelului seric de leptină și expresia de ARNm de leptină adiposă în țesutul adipos la șoareci cu deficit de SCD1. Experimentul de substituție a confirmat în continuare că scăderea nivelului de leptină a contribuit semnificativ la rolul protector al deficitului de SCD1 în inducția CIH.

Mai mulți regulatori cunoscuți ai metabolismului lipidelor care stimulează oxidarea grăsimilor, inclusiv metformina și acizii grași polinesaturați omega-3, s-au dovedit a avea activitate hepatoprotectoare împotriva leziunilor hepatice mediate de imunitate. 40, 41 În acest studiu, am demonstrat clar că inactivarea SCD1, un regulator cheie al metabolismului lipidic, protejează șoarecii de CIH. Efecte de protecție similare au fost observate după pretratarea șoarecilor cu activator AMPK metformin (datele noastre nepublicate). Descoperirile noastre oferă dovezi directe că reglarea metabolismului energetic poate modifica răspunsurile imune în ficat. Acest lucru sugerează o nouă abordare pentru înțelegerea și, eventual, controlul diafragmei dintre metabolismul energetic și sistemul imunitar din ficat. O astfel de abordare poate ajuta și îmbunătăți tratamentul bolilor hepatice în viitor.