obiecte

abstract

Coenzima Q10 (CoQ 10) joacă un rol important în metabolismul energiei mitocondriale prin funcția sa de purtător de electroni în lanțul respirator. Defectele genetice care perturbă calea biosintetică endogenă a CoQ 10 pot duce la tulburări metabolice severe cu debut în copilăria timpurie. Folosind secvențierea exoma la copiii cu acidoză lactică neonatală fatală și encefalopatie, am identificat o variantă homozigotă a pierderii funcției în COQ9. Studiile funcționale la pacienții cu fibroblaste au arătat că absența proteinei COQ9 a fost însoțită de o reducere puternică a COQ7, ducând la o acumulare semnificativă a substratului COQ7, 6-demetoxi-ubiquinonă 10. În același timp, cantitatea totală de CoQ 10 a fost semnificativ redusă, ceea ce s-a reflectat într-o reducere semnificativă a activității lanțului respirator mitocondrial succinat-citocrom c oxidoreductază (complexul II/III). Expresia lentivirală a COQ9 a restabilit toți acești parametri și a confirmat rolul cauzal al variantei. Raportul nostru privind al doilea pacient cu COQ9 extinde spectrul clinic asociat cu variantele COQ9, subliniind importanța COQ9 în timpul dezvoltării prenatale. În plus, salvarea nivelurilor celulare de CoQ 10 și activitatea complexă a lanțului respirator prin completarea CoQ 10 indică importanța diagnosticului precoce și a tratamentului imediat.

Coenzima Q10 (CoQ 10) este o substanță solubilă în grăsimi, o substanță naturală care acționează ca un cofactor esențial în lanțul respirator mitocondrial. 1 Acționează ca un purtător de electroni de la complexul I și complexul II la complexul III și, prin urmare, suferă un ciclu redox între forma oxidată (ubiquinonă) și cea redusă (ubiquinol). În plus, CoQ 10 leagă beta-oxidarea mitocondrială a acizilor grași de lanțul respirator, este implicată în biosinteza pirimidinei și modulează apoptoza. 2 În forma sa redusă, molecula CoQ 10 servește ca un puternic antioxidant.

CoQ 10 se obține prin biosinteză sau aport alimentar. Cu toate acestea, biosinteza este o sursă majoră de CoQ10, care implică funcția coordonată a cel puțin 13 gene (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ3, COQ4, COQ5, COQ6, COQ7, ADCK3, ADCK4, COQ9, COQ10A și COQ10B). Până în prezent, defectele la opt dintre aceste gene au fost identificate ca fiind cauza tulburărilor primare de deficit de CoQ 10 (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ4, COQ6, ADCK3, ADCK4 și COQ9), un grup clinic eterogen de boli care se manifestă adesea în copilărie ., 4 Potrivit lui Quinzii și colab. Se pot distinge 5 fenotipuri clinice principale: (1) encefalomiopatie, (2) boală multisistemică infantilă severă, (3) nefropatie, (4) ataxie cerebelară și (5) miopatie izolată. Identificarea deficitului de CoQ 10 este importantă, deoarece suplimentarea CoQ 10 poate fi benefică în anumite condiții.

Până în prezent, a fost raportat un singur pacient cu deficit de CoQ 10 din cauza unei variante de arestare homozigotă la COQ9 c.730C> T, p.Arg244 *, ceea ce duce la acidoză lactică neonatală, convulsii incontrolabile și întârziere globală a dezvoltării. Folosind secvențierea exomei, am identificat o nouă variantă care afectează funcția în COQ9 asociată cu encefalopatia neonatală și moartea timpurie. Raportul nostru extinde spectrul clinic asociat cu variantele COQ9 și indică un fenotip sever cu debut pre/neonatal. Fibroblastele pacienților cu deficit de COQ9 au fost caracterizate în detaliu și sunt prezentate consecințele funcționale ale defectului genetic.

Raport de caz

Băiatul raportat aici a fost al doilea copil de părinți turci sănătoși, de primă clasă. Fratele său de 13 ani este sănătos. Sarcina a fost normală până în a 27-a săptămână gestațională, când s-a observat oligohidramnios. În acel moment, părinții au respins cezariana recomandată. În cele din urmă, bebelușul s-a născut în a 36-a săptămână de sarcină prin cezariană din cauza anhidramniului. Scorul APGAR a fost 5/4/6. Nou-născutul a fost mic pentru vârsta gestațională, cu o greutate la naștere de 1440 g, o lungime de 39,5 cm și o circumferință a capului de 28,8 cm (toate valorile sub percentila a 3-a). Nu s-au observat stigme dismorfice. În perioada imediat postnatală, pacientul a avut un efort respirator slab, hipotensiune musculară, bradicardie și cianoză generalizată. Bebelușul a fost intubat și transferat la o unitate de terapie intensivă neonatală. Testele de laborator au evidențiat acidoză lactică (până la 22 mmol/l; standard: 160), indicând un defect al metabolismului CoQ 10. Examinările histologice ale țesutului muscular și hepatic au fost fără rezultate specifice.

encefalopatie

A ) Ecografia creierului la un nou-născut cu o variantă patogenă a COQ9. Panourile din stânga și din mijloc: vederi parasagittale din dreapta și din stânga, respectiv, care arată un semnal hiperecogen în ganglionii bazali (săgeată) și ciorozele bilaterale ale plexului coroid (asterisc). Panoul din dreapta: vedere coronară care demonstrează anomalii simetrice ale ganglionilor bazali hiperecogeni sugerând un sindrom neonatal asemănător Leigh. ( b ) Diagrama schematică care arată transcrierea generată în prezența ștergerii c.521 + 1. Cromatograma arată că ștergerea face ca exonii 4 și 5 să fie omiși în fibroblastele pacienților. ( c ) Western blot pe fracțiuni de pacienți și fibroblaste de control îmbogățite cu mitocondrii (imagine reprezentativă). Nu se detectează COQ9 netransdus (Q) în celulele pacienților. Semnalul este restabilit după transducția lentivirală cu ADNc CQ9 de tip sălbatic. În plus, a fost utilizat anticorpul COQ7, care a demonstrat o reducere severă a proteinei COQ7 în celulele pacienților. Porin (VDAC) a fost folosit ca marker de încărcare.

Imagine la dimensiune completă

Materiale și metode

O descriere detaliată a materialelor și metodelor utilizate în acest document poate fi găsită în materialul suplimentar.

rezultate si discutii

Pentru a dezvălui cauza genetică a bolii, am efectuat secvențierea exoma așa cum s-a descris mai sus. 7 Presupunând un mod de moștenire autosomal recesiv, analizele noastre s-au concentrat pe variantele heterozigoice homozigote și prezise non-sinonime cu MAF 9

Am examinat în continuare efectul variantei asupra expresiei COQ9 prin imunodecolarea proteinelor îmbogățite mitocondriale utilizând un anticorp specific pentru COQ9. Folosind cantități diferite de proteine ​​mitocondriale, nu am reușit să detectăm COQ9 în celulele pacienților, în timp ce am detectat întotdeauna COQ9 în controale, indicând degradarea proteinei trunchiate (Figura 1c).

Mai mult, am măsurat mai multe enzime mitocondriale spectrofotometric folosind fracții de fibroblast îmbogățite mitocondrial. Pentru a determina activitatea lanțului respirator II/III, am măsurat reducerea citocromului c. Pentru activitatea complexului IV, am monitorizat oxidarea citocromului redus c și activitatea citratului sintază, un marker enzimatic al matricei mitocondriale, a fost măsurată după reducerea 5,5'-dithiobis- (acid 2-nitrobenzoic). În concordanță cu defectul de biosinteză CoQ 10 și defectul găsit în fibroblaste, celulele pacientului au prezentat o scădere semnificativă a activității complexe II/III (Figura 2a).

Exprimarea COQ9 în celulele martor cu niveluri normale sau reduse de CoQ 10 din cauza variantelor de COQ2 nu a avut niciun efect asupra activității complexe II/III (Figura 2a). Cu toate acestea, după exprimarea ADNc de tip sălbatic la fibroblastele pacienților care au variante COQ9, am observat o creștere semnificativă de 4 ori a activității complexe II/III.

Deoarece COQ9 este implicat în biosinteza CoQ 10, cantitatea totală de CoQ10 a fost măsurată prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cuplată cu spectrometrie de masă tandem (UPLC-MS/MS). Ambele linii celulare de pacienți CoQ 10 au prezentat niveluri semnificativ reduse de CoQ 10, cu 10 pmol/mg proteină în fibroblaste variante COQ2 și 7,3 pmol/mg proteine ​​în fibroblaste variante COQ9 (interval normal 46, 5-90, 5 pmol/mg proteină). După transducție, fibroblastele mutante COQ9 au arătat o creștere semnificativă (aproximativ de 3 ori) a nivelurilor CoQ 10, în timp ce nivelurile CoQ 10 au rămas neschimbate în celulele mutante COQ2 (Figura 2b). Aceste descoperiri sunt dovezi ale unei relații cauzale între varianta identificată de COQ9, deficiența de CoQ 10 și activitatea complexă II/III redusă.

Cercetările efectuate pe un model de șoarece și studii recente la om au arătat că COQ9 este o proteină care leagă lipidele, care are omologie structurală față de familia TFR (regulatori de transcripție bacteriană). 9, 11 Lohman și colab. 9 a demonstrat că COQ9 este puțin probabil să acționeze ca factor de transcripție și a sugerat că componenta structurală a TFR se reproduce în timpul evoluției. În loc să catalizeze o reacție specifică de biosinteză a CoQ10 singur, s-a speculat că COQ9 se leagă fie la CoQ 10, fie la precursorul CoQ10 și formează un complex cu COQ7. COQ7 catalizează hidroxilarea 6-demetoxi-CoQ10, care este o etapă preliminară în biosinteza CoQ. O cantitate semnificativ redusă de COQ7 în linia celulară a pacientului, care este salvată de o creștere a COQ9, indică funcția COQ9 de stabilizare a COQ7 (Figura 1c).

Trebuie remarcat faptul că un potențial intermediar al biosintezei CoQ10 a fost descris la șoarecii mutanți COQ9, precum și la fibroblastele umane. 6, 11 La șoareci, acest metabolit a fost identificat ca 6-demetoxi-ubiquinonă 9. Studiile detaliate la om lipsesc încă. Pentru a caracteriza metabolitul din celulele umane, am efectuat diverse tehnici analitice UPLC-ESI-MS/MS, cum ar fi scanarea, scanarea ionilor precursori sau regimul de monitorizare a reacțiilor multiple. În concordanță cu studiile efectuate la șoareci, am detectat în mod specific 6-demetoxi-ubiquinonă 10 în fibroblaste COQ9 (Figura 2c și d). Deoarece 6-demetoxi-ubiquinonă 10 este COQ7 hidroxilată pentru a forma 6-hidroxi-ubiquinonă 10, acumularea acestui intermediar poate fi explicată prin cantitatea redusă de COQ7. 9 Așa cum era de așteptat, expresia COQ9 a normalizat nivelurile de COQ7 și 6-demetoxi-ubiquinonă 10 (Figura 2d). Metabolitul nu a fost detectat în alte linii celulare.

Suplimentarea CoQ 10 este benefică la unii pacienți cu deficit de CoQ 10. Pentru a testa efectul tratamentului în liniile noastre celulare, le-am completat cu 5 μM CoQ 10 timp de 1 săptămână, în conformitate cu Lopez și colab. Tratamentul 12 CoQ 10 a salvat activitatea complexă II/III în fibroblaste ale mutanților mutanți COQ9 în mod semnificativ până la -80% din cea mai mică valoare de control (Figura 2e). Aproape același efect a fost observat la fibroblastele mutante COQ2, în timp ce nu s-au măsurat diferențe la fibroblastele de control. Conținutul de CoQ 10 în fibroblastele pacienților a crescut semnificativ până la aproximativ 11 ori după tratament și a atins valorile de control (Figura 2b). Interesant este că nu a fost detectată 6-demetoxi-ubiquinonă 10 la pacienții cu fibroblaste cu un defect genetic în COQ9 după tratamentul cu CoQ 10, care se poate datora biosintezei endogene reduse prin suplimentarea exogenă suficientă a CoQ 10 (Figura 2d).

În cele din urmă, studiul nostru oferă informații suplimentare asupra consecințelor clinice și celulare ale deficitului de COQ9. Cursul clinic sever observat la pacientul nostru sugerează o funcție critică a COQ9 deja în timpul dezvoltării prenatale. Cazul, împreună cu descrierea lui Duncan și colab., Plasează deficitul de COQ9 printre cele mai grave forme de tulburări ale metabolismului CoQ 10, comparabile cu cele descrise la pacienții cu tulburări COQ2 sau COQ4. Cu toate acestea, vor fi necesare descrieri clinice suplimentare pentru a evalua spectrul clinic specific al pacienților cu mutații COQ9. După cum sugerează Duncan și colab. 6 Tratamentul CoQ 10 poate fi util la copiii cu deficit de COQ9. Prin urmare, în cazuri neclare de boală mitocondrială neonatală/copilărie timpurie, se recomandă tratamentul empiric cu CoQ 10. .