Abstract

Nitrofuranii sunt un grup de medicamente puternice antibacteriene cu spectru larg, care au, de asemenea, activitate antiprotozoică. Acestea sunt încă utilizate pentru a trata multe infecții bacteriene și protozoice la animalele producătoare de alimente din întreaga lume, în special la porci și păsări de curte, și sunt capabile să inducă cancer, precum și alte efecte secundare toxice în diferite modele de modele experimentale. 1, 2, 3 Astfel de dovezi au fost acceptate ca bază pentru interzicerea utilizării lor în sănătatea animalelor în multe țări.

La sfârșitul anilor 1980, pe baza ideii de prevenire a carcinogenului la consumatorii umani de către Suplimentul Delaney, Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente a interzis utilizarea furazolidonei (FZD) și a nitrofurazonei (ulterior extinsă la furaltadonă) pentru utilizare în alimente. tratamentul bolilor animalelor producătoare de alimente. Cu toate acestea, din perspectiva SUA-străină, această interdicție poate fi pusă sub semnul întrebării. Inducerea cancerului a fost găsită la animalele de laborator care au primit în mod direct cantități mari de nitrofuran în cauză; 1, 2, 4, dar oamenii nu riscă să consume reactiv nitrofuran din surse de hrană pentru animale, ci mai degrabă reziduuri ale principalilor metaboliți: 2,3-dihidro-3-cianometil-2-hidroxi-5-nitro-1alfa, 2 -di (2-oxo-oxazolidin-3-il) iminometil-furo-2,3-β-furan, numit și 3-amină-2-oxazolidonă (AOZ) și un metabolit minor, N- (5-amino- 2) -furfuriliden) -3-amino-2-oxazolidonă (FOZ). Până în prezent, nu există dovezi convingătoare că AOZ/FOZ poate induce modificări genotoxice sau cancerigene.

La fel ca la mamifere, peștii metabolizează FZD în AOZ și FOZ prin citokomul P-450; prin urmare, ele pot fi utilizate pentru a studia efectele cancerigene pe care le pot produce atât FZD, cât și metaboliții săi AOZ/FOZ. Se știe că speciile de pești ginogenetici ornamentali Poecilia formosa (molii), ale căror progenitori și descendenți sunt identici genetic, sunt susceptibili la dezvoltarea tumorii, în parte datorită procesului lor special de reproducere. Această specie a fost considerată un model adecvat pentru testarea potențialului cancerigen al medicamentelor, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 și poate fi utilizată pentru a studia efectele cancerigene directe ale FZD, precum și efectele indirecte. AOZ. Comparația acestor efecte a fost efectuată și în tilapia (Oreochromis niloticus).

MATERIAL SI METODE

Mollies (Poecilia formosa)

În toate cazurile, s-au folosit 1.350 moli, fiecare cu lungimea de 2 cm și cântărind aproximativ 1,2 g. Peștele a fost împărțit în iazuri de sticlă de 40 l, cu o rată de apă de 50% pe săptămână. Un volum de 1 L de aer/min a fost pompat (Wave Pumps, W Lim Corporation, El Monte, CA, SUA) în fiecare pentru a menține o concentrație de oxigen în apă de 5 ppm. Temperatura termostatului a fost de 23 ° C. Variabilele apei (oxigen, temperatură și pH) au fost măsurate zilnic (oximetru și termometru digital cu precizie, American Marine Inc., Ridgefield, CT, Cherstertown, MA, SUA). Amoniacul, nitritul, duritatea apei și conținutul de fosfați au fost măsurate folosind un sistem automat (Aqua LaMotte, Cherstertown, MA, SUA).

În grupul Am, trei replici de 100 moli au fost medicate cu 11 mg FZD/kg furaj/zi timp de 12 săptămâni. În fiecare săptămână, șapte moli de replicare au fost demeduse și menținute în formaldehidă tamponată 10%. Probele de pește au fost prelucrate pentru analiza histopatologică utilizând includerea standard în colorarea cu ceară și hematoxilină-eozină. A fost inclus un grup de control (control Am) de 100 de molari netratați. În grupul Bm, 300 de femei tratate cu FZD au primit aceeași doză ca mai sus și au fost împărțite în trei replici și stimulate să reproducă guppy (Poecilia reticulata) la sfârșitul săptămânii 12. Un grup de control netratat de 100 moli a fost, de asemenea, determinat și indus pentru reproducere așa cum s-a descris mai sus (control Bm). Progenia din grupele Bm și grupurile Bm de control au fost hrănite cu o dietă comercială standard, fără FZD și, odată ce au atins dimensiunea de 1 cm, 20 de pești pentru replicare au fost uciși și prelucrați așa cum este descris mai sus pentru analiza histopatologică.

În grupul Cm, după 12 săptămâni de medicație, 11 mg FZD/kg de furaje au produs 350 de pui hrăniți cu furaje FZD. Această făină de pește a fost apoi încorporată în alimente comerciale fără timp de centrifugare la 500 g de făină de pește/kg de furaje comerciale. Un total de 100 de molii (grup Cm1) au fost hrăniți cu această doză timp de 12 săptămâni. Doza calculată de AOZ a fost de 1,25 μg/kg molii de biomasă, pe baza consumului de furaje de 5% din greutatea biomasei. La sfârșitul acestei perioade, peștele a fost procesat așa cum este descris mai sus pentru a căuta tumori. De asemenea, a fost creat un grup de control netratat de 100 molies (control Cm).

Tilapia (Oreochromis niloticus)

În această fază s-au folosit 325 tilapii masculi juvenili cu o lungime de 2 cm. Grupul At a inclus 65 de pești pe replică și trei replici plus 65 de pești suplimentari pe grup de control netratat (la control). Animalele au fost atribuite așa cum s-a descris anterior. Peștele a primit o dietă comercială suplimentată cu FZD la o doză de 50 mg/kg de furaje timp de 60 de zile. La sfârșitul acestei perioade, aproximativ jumătate din acești pești au fost sacrificați și prelucrați pentru analize macroscopice și histopatologice așa cum s-a descris anterior. Cealaltă jumătate a fost făcută din făină de pește și încorporată într-o dietă comercială la 500 g/kg de furaje comerciale. Doza calculată de AOZ a fost de 1,6 μg/kg de biomasă tilapia în ceea ce privește consumul de furaje de 5% din greutatea biomasei. Grupul Bt de 65 de tilapii a fost hrănit cu acest reziduu FZD conținând o dietă timp de 12 săptămâni sub formă de medicament AOZ/FOZ. Datele de control din grupul netratat au fost, de asemenea, considerate grupul de control pentru grupul Bt.

Distribuția grupurilor în cele două specii de pești este rezumată în Tabelul 1.

Tabel în dimensiune completă

Făina de pește molară și tilapia a fost procesată pentru a detecta AOZ și FOZ așa cum este descris în Conneely și colab. 16 în triplicat folosind o coloană de separare Inertsil ODS (150 x 4,6 mm ID) și 5 mM acid oxalic-acetonitril (55: 45) ca celulă telefon. cu detectare UV-vis la 265 nm (0,04 aufs).

Analiza statistică a datelor a fost efectuată folosind testul de probabilitate exact nonparametric al lui Fisher.

REZULTATELE

Variabilele fizico-chimice evaluate au rămas constante în toate testele cu ambele specii, cu următoarele valori medii: temperatura 23,66 ± 1,2 ° C; pH 6,7 ± 0,6; amoniu 0,730 ± 0,09 mg/l; fosfați 3,0 ± 0,5 mg/l; nitrați 0,41 ± 0,5 mg/l; oxigen 5,6 ± 0,5 mg/l și duritate a apei (măsurată pentru conținutul de calciu) 120 ± 6,5 mg/l.

Analiza HPLC a relevat prezența AOZ în făina de pește preparată atât cu alunițe, cât și cu tilapie în cantități de 25 ± 8, 5 și 32 ± 4,8 μg/kg. Doar urme necuantificabile de FOZ au fost găsite în ambele probe de făină de pește. Aceste concentrații de AOZ au permis dozele de AOZ corespunzătoare 1,25 μg/kg de biomasă molla și 1,6 μg/kg de biomasă tilapia.

Mollies (Poecilia formosa)

Studiile histopatologice ale alunițelor au arătat o indicație clară a steatozei hepatice la toate probele de pești tratați cu FZD. Animalele de control nu au prezentat o astfel de leziune. Începând cu săptămâna 3 până la sfârșitul studiului, peștii tratați cu FZD au arătat o creștere semnificativă a melanohistocitoamelor ficatului, pancreasului, rinichilor și gonadelor. Figura 1a și b prezintă câteva exemple ale acestor descoperiri. Incidența săptămânală a prezentării tumorii melanohistocitomului renal (a) și/sau hepatic (b) a fost următoarea: niciuna în primele 2 săptămâni, apoi 10, 24, 30, 36, 36, 44, 46, 48, 46 și 44, de la 3 la Săptămâna 12. Testul de probabilitate exact al lui Fisher arată că, comparativ cu săptămânile 1 și 2 și grupul de control, grupul tratat cu FZD a avut o creștere semnificativă statistic a tumorilor de la săptămânile 3 până la săptămâna 12 (P

efectelor

Melanohistocitoame renale (a) și hepatice (b) induse de moluște hrănite cu FZD (Poecilia formosa) la 0,011 g/kg furaj/zi timp de 12 săptămâni.

Imagine la dimensiune completă

Tilapias (Oreochromis niloticus)

Nu au fost observate tumori la niciunul dintre peștii tratați cu FZD și nici la tilapia hrănită cu tilapie. În schimb, steatoza hepatică a fost găsită în toate tilapiile tratate cu FZD. Peștii de control netratați nu au prezentat această leziune.

DISCUŢIE

Variabilele fizico-chimice evaluate în apă nu s-au modificat semnificativ în niciun set de experimente. Prin urmare, s-a ajuns la concluzia că este foarte puțin probabil ca fluctuații observate foarte mici să afecteze rezultatele observate. Carcinogeneza experimentală folosind specii de pești ca modele alternative a fost descrisă ca un domeniu de cercetare dinamic, atractiv și valoros. 11, 12 Poecilia formosa este o linie feminină de pești vii care suferă mutații frecvente, au transmisie clonală și au cel puțin două loci cu adevărat hipervariabile care demonstrează că moluștele sunt susceptibile la modificări mutaționale atât din stimuli fizici, cât și chimici. 13, 14, 15 De fapt, această specie de pește a fost considerată mai avantajoasă decât utilizarea rozătoarelor pentru a testa potențialul cancerigen. Prin urmare, rezultatele acestui experiment susțin utilizarea acestei specii de pești pentru screeningul substanțelor potențial cancerigene.

Obiectivul principal al acestui experiment a fost compararea/contrastul efectelor hrănirii FZD sau AOZ/FOZ în două modele de pești: unul predispus la tumori (Poecilia formosa) și celălalt (Oreochromis niloticus), care nu se distinge. De asemenea, în cazul moliurilor, generațiile succesive au fost testate pentru a evalua posibila acumulare sau efect genomic asupra celulelor germinale. Așa cum era de așteptat, dovezile adunate în această pistă sunt de acord cu faptul că FZD este cancerigen. 1, 2, 4, 17, 18 În acest studiu particular, tipul de cancer indus de FZD a fost definit ca melanohistiocitom. Aceste tumori devin mai clare și mai severe odată cu expunerea la FZD. În contrast, niciuna dintre aceste tumori nu a fost găsită nici în alunițe, nici în tilapia hrănită cu molii contaminate cu AOZ/FOZ sau cu făină de tilapia, sau în descendenții alunițelor care au supraviețuit perioadei de tratament FZD de 12 săptămâni.

Provocarea propusă, folosind metaboliți FZD legați de proteine, a fost efectuată la concentrații de AOZ/FOZ în făină de pește (de la molii și din tilapii) care au fost semnificativ mai mari decât concentrațiile raportate de AOZ în carnea de porc la animalele tratate cu FZD. Acest lucru se explică prin proces de deshidratare necesar preparării făinii de pește. Această metodologie diferă de simpla adăugare de AOZ la hrană, deoarece se crede că AOZ de la animalele tratate cu FZD este legat covalent de proteinele tisulare, asemănându-se mai mult cu un lanț trofic.

Un alt scop al acestui experiment a fost de a evalua efectele acumulării lanțului alimentar de metaboliți FZD în generațiile următoare. Nu a fost detectat niciun efect distinct în acest proces. De fapt, lipsa capacității AOZ/FOZ de a induce tumori constatate în aceste studii, cel puțin pentru alunițe și tilapie, se potrivește mai bine studiilor care arată o lipsă de mutagenicitate legată de țesut a AOZ cu sau fără activare metabolică și care utilizează Salmonella /. analiza microsomului, 20 decât presupunând că AOZ/FOZ este potențial potențial toxic pentru celule precum FZD. Klee și colab. 21 nu a detectat toxicitatea acută a AOZ sau a reziduurilor alimentare digerate în segmentele intestinale și celulele Caco-2 la concentrații care au fost semnificativ mai mari decât nivelurile maxime de reziduuri așteptate în alimentele de origine animală după administrarea dozelor terapeutice. Cu toate acestea, pentru a determina cu mai mare certitudine dacă AOZ/FOZ este inofensiv pentru consumatori, va fi util să repetați acest experiment folosind cantități mai mari de AOZ și FOZ purificate și legate de proteine, precum și prelungirea timpului de expunere. la acești reactivi.

Melanohistiocitoamele sunt tumori benigne ale centrelor melanomacrofagelor. Acești centri sunt perfect încapsulați de țesut conjunctiv fibros, în special în ficat și diferite organe, cum ar fi pancreasul și rinichii. Se știe că aceste celule au o rată mare de diviziune celulară; de aceea, responsabilitatea lor oncogenică devine mai mare. Acesta pare să fie cazul speciei Poecilia formosa, care a necesitat doar 3 săptămâni de expunere la FZD pentru a dezvolta astfel de tumori. Deși metaboliții combinați ai AOZ/FOZ tolerează doar mici modificări ale structurii chimice, sunt suficienți pentru a elimina drastic activitatea cancerigenă a FZD.

Steaoză a fost o constatare frecventă la toți pești tratați cu FZD, tilapie și molie, dar această constatare nu a fost observată la grupurile de control. Procentul de grăsimi din dietă a fost adecvat, adică 8% pentru moluri și tilapie. Deoarece peștii martor nu au prezentat steatoză, este puțin probabil ca digestibilitatea sursei de grăsime din furajele comerciale să poată fi parțial responsabilă de această leziune. Pe de altă parte, sa demonstrat că FZD poate induce astfel de modificări. Cu toate acestea, este foarte puțin probabil ca steatoza să aibă vreo legătură cu proprietățile induse de tumori ale FZD sau cu lipsa acestui efect observată pentru AOZ/FOZ.

În tilapie, nici o doză relativ mare de FZD timp de 90 de zile, nici masa tilapică contaminată cu AOZ/FOZ nu au indus tumori detectabile. Aceste rezultate sugerează, de asemenea, că FZD este abia cancerigen pentru animalele producătoare de alimente atunci când este utilizat la doze terapeutice și pentru o perioadă de timp rezonabilă. De fapt, o revizuire amănunțită a literaturii cu ajutorul băncilor de date automatizate nu a dezvăluit o singură referință la efectul direct inducător al tumorii al FZD la speciile producătoare de alimente.

Peștele dozat cu alimente suplimentate cu FZD și apoi folosit pentru a produce făină de pește pentru a hrăni alți pești pare a fi un pas suficient pentru a scăpa FZD de proprietățile sale cauzatoare de cancer. Această viziune este în concordanță cu dovezile recente care pun sub semnul întrebării pericolele pe care le poate prezenta FZD pentru sănătatea umană atunci când este utilizat ca aditiv pentru hrana animalelor în medicina veterinară. Aceste rezultate pot fi luate în considerare în țările în care nitrofuranii sunt încă utilizați în sănătatea animalelor și ale căror guverne încă investighează aceste substanțe. Cu toate acestea, aplicarea acestor rezultate în evaluările riscurilor pentru consumatori nu a făcut obiectul unui studiu și este responsabilitatea agențiilor de reglementare din țările în cauză.