obiecte
abstract
Asamblarea și depozitarea proteinei β amiloide (Aβ) este un eveniment major în stadiile incipiente ale bolii Alzheimer (AD) și ale angiopatiei amiloide cerebrale. Un număr tot mai mare de dovezi sugerează că gangliozidele formează o platformă patologică pentru formarea gangliozidului legat de Aβ, care facilitează asamblarea Aβ solubil; cu toate acestea, mecanismele moleculare care stau la baza legării Aβ de gangliozide din creier rămân neclare din cauza lipsei unui sistem in vivo care ar putea aborda această problemă. La insecte, inclusiv musca fructului Drosophila melanogaster, gangliozidele nu sunt prezente în mod natural la un nivel detectabil. Aici, am demonstrat că expresia gangliozidelor este inductibilă în Drosophila prin expresia transgenelor enzimelor de sinteză a gangliozidelor și prin livrarea de acid sialic exogen și, de asemenea, că inducerea sintezei gangliozidelor accelerează semnificativ asamblarea Aβ in vivo. Rezultatele noastre susțin ipoteza că gangliozidele sunt responsabile pentru asamblarea Aβ in vivo și oferă, de asemenea, o oportunitate de a dezvolta un model valoros pentru cercetarea de bază, precum și o strategie terapeutică pentru AD.
În timpul investigației ipotezei GAp, zona de focalizare a fost depunerea specifică zonei a tipurilor de variante de Aβ care sunt moștenite genetic. De exemplu, o mutație de tip olandez (E22Q) determină depunerea amiloidului predominant în peretele vasului cerebral 5, 6, sugerând că acest perete, care constă în principal din celule musculare netede vasculare, exprimă gangliozide unice care inițiază în mod favorabil agregarea celulară olandeză. tip Ap. Pentru a investiga această posibilitate, am analizat gangliozidele din celulele musculare netede vasculare și am găsit expresia exclusivă a GM3 și, într-o măsură mai mică, a GM2 7. În plus, așa cum era de așteptat, ansamblul tipului olandez Aβ a crescut semnificativ în prezența GM3 7 .
Scopul acestui studiu a fost de a investiga în continuare ipoteza GAp folosind modelul Drosophila, în care a fost manipulată inducția GM3 și Aß de tip olandez. Aici am demonstrat că ansamblul Aß de tip olandez a fost accelerat semnificativ la muștele induse de GM3.
Rezultatul
Inducția transgenică a GalT6 și SAT1 pentru producția LacCer
Gangliozidele sunt glicosfingolipide și sunt conservate evolutiv la mamifere; cu toate acestea, majoritatea nevertebratelor, inclusiv insectele, nu conțin gangliozide în celulele lor. Într-o etapă inițială în calea de sinteză a gangliozidelor la mamifere, GM3 este generat din glucozilceramidă (GlcCer) prin lactosilceramidă (LacCer) (Fig. 1). Sinteza GM3 (Fig. 1) este responsabilă de 1,4-galactoziltransferază LacCer sintază ß1, 4-galactoziltransferază (GalT6/5) și α2,3-sialiltransferază GM3 sintază (SAT1, cunoscută și sub numele de ST3GAL5 sau GM3S).
Schema de inducție a gangliozidelor. Calea de sinteză a gangliozidelor de mamifere (stânga), calea endogenă a Drosophila (mijlocul 8) și calea transgenică Drosophila (chiar în acest studiu). Cutiile umplute indică donatorii de zahăr sau SA. La vertebrate, primul gangliozid, GM3, este format din glucozilceramidă (GlcCer) prin lactosilceramidă (LacCer). În calea endogenă a Drosophila, GlcCer este modificat de mannosiltransferaza Egghead și GlcNAc transferaza Brainiac. Am indus expresia GM3 folosind construcții transgenice (Tg) și hrănirea muștelor SA donatoare. În plus, calea de sinteză CMP-SA este parțial conservată în Drosophila (vezi figura suplimentară S2).
Imagine la dimensiune completă
Deoarece GalT6/5 și SAT1 nu au fost detectate în Drosophila, am creat un sistem de inducție GM3 cu muște transgenice care transportă GalT6 și SAT1 umane (Fig. 1). Aceste transgene au fost exprimate cu driverul pan-neuronal C155-Gal4 și lipidele totale au fost extrase din capetele zburătoare adulte. Folosind cromatografia lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS), am identificat semnalele hexoză-hexoză-Cer (Hex-Hex-Cer) la muștele care exprimă GalT6, dar nu la muștele care nu exprimă GalT6 (Figura suplimentară S1). Deoarece Man-Glc-Cer endogen (MacCer) este un intermediar rapid metabolizat și transgenic GalT6 este responsabil pentru biosinteza LacCer, aceste semnale pot fi atribuite generației de Gal-Glc-Cer (LacCer), sugerând că GalT6 exogen induce LacCer în Drosophila ca mai sus 8 (Fig. 2a, c).
Analiza LC-MS a LacCer și GM3. Lipidele extrase din capetele Drosophila au fost analizate prin LC-MS MRM. S-a presupus că toate structurile ceramidice ale LacCer și GM3 erau prezente pe baza unui studiu anterior care arăta că cele mai abundente specii de ceramide din Drosophila conțineau sfingozină ( d14: 1 ) 17. Lipidele din SNC larvale care coexprimă transgenele ( A ) GalT6 și SAT1 sau ( b ) GalT6, SAT1 și GNE. Lipidele din capul muștelor adulte ( c ) coexprimă transgenele pentru GalT6 și SAT1 sau ( d ) coexprimă transgenele pentru GalT6 și SAT1 și alimentează Neu5Ac.
Imagine la dimensiune completă
Inducerea experimentală a GM3 la muște
De asemenea, am exprimat SAT1 în muștele fructelor cu GalT6; Cu toate acestea, GM3 nu a fost sintetizat la aceste muște (Figurile 2a, c și Tabelul 1). Am emis ipoteza că metabolismul SA la insecte poate diferi de metabolismul la mamifere 9. În sprijinul acestei idei, studiile anterioare au constatat că donatorul de citozină-5'-monofosfat SA (CMP) -Neu5Ac nu a fost detectat la muștele fructelor, deși a fost publicată o sialiltransferază funcțională Drosophila 10, 11, 12, 13. Am considerat că CMP-Neu5Ac ar putea să nu fie disponibil pentru modificări ale glicolipidelor și am sugerat că acesta este motivul lipsei producției de gangliozide la muștele fructelor. Am folosit abordări genetice și chimice pentru a rezolva această problemă.
Tabel în dimensiune completă
Accelerarea asamblării Aβ in vivo la muște induse de GM3
Studiile anterioare au arătat că GM3 arată o puternică afinitate pentru tipul olandez Aβ și relația dintre GM3 și tipul olandez Aβ accelerează asamblarea in vitro a Aβ 7,18. Pentru a confirma aceste descoperiri folosind sistemul nostru de inducție GM3, am generat muște transgenice care transportă tipul olandez Aβ40 sau Aβ42 (în continuare Dut40 sau Dut42). La pacienții umani și șoarecii transgenici cu un mutant de tip olandez, Aβ40 se găsește predominant în depozitele de amiloid 19. Am folosit Aβ42 de tip sălbatic (WT42) ca control pentru calea de producție a Aβ, deoarece pacienții cu AD de tip sporadic și șoareci transgenici precursori ai proteinelor prezintă depozite dominante de Aβ42, iar Aβ de tip sălbatic are o afinitate semnificativ mai slabă decât Dut40 pentru GM3. 18 .
Transgenic GalT6, SAT1 și WT42 sau Dut40 au fost exprimate continuu în sistemul nervos al muștei și GM3 a fost indus la aceste muște prin hrănirea Neu5Ac așa cum este descris mai sus. Extractele întregi de aripioare adulte au fost împărțite în fracții solubile în TBS și fracții insolubile. Sinteza GM3 a accelerat asamblarea Dut40 în creierul lor (Fig. 3a, c). În schimb, WT42 nu a accelerat asamblarea în aceste condiții (Fig. 3b, c). Hrănirea cu Neu5Ac numai nu a crescut asamblarea Dut40 la muștele care nu exprimă GalT6/SAT1 (Fig. 3d), sugerând că Dut40 este mai susceptibil la acumularea în prezența GM3 in vivo și că GM3 nu afectează Aβ la aceste niveluri. producție.
Pe lângă faptul că sunt implicați în procesul patologic al dezvoltării AD, gangliozidele sunt, de asemenea, un factor în alte boli la om, de ex. Diabet zaharat de tip 2, surditate, invazie tumorală și boala Parkinson (PD) 22, 28, 29, 30. La pacienții cu diabet zaharat de tip 2, niveluri crescute de GM3 determină inactivarea receptorului de insulină prin întreruperea microdomeniilor membranei, ducând la rezistența la insulină 28. În schimb, pierderea GM3 induce disfuncții auditive, deoarece este necesară menținerea structurii corespunzătoare a celulelor cohleare 22. S-a demonstrat că scăderea inducției GM3 este asociată cu transformarea malignă 29. În plus, un studiu recent a raportat că tratamentul in vitro cu gangliozidă a dus la acumularea accelerată de α-sinucleină, un factor cauzal major al PD31. Deci, sistemul nostru de inducție GM3 inductibil din Drosophila poate contribui la înțelegerea mecanismelor care stau la baza dezvoltării acestor boli umane.
metode
Stoc zburați
Muștele au fost menținute pe mediu agar standard cu făină de porumb și drojdie la 25 ° C într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Linia elav-GAL4 c155 (C155-Gal4) a fost obținută de la Bloomington Drosophila Stock Center (Universitatea Indiana). Tulpina w1118 a servit ca tip sălbatic. UAS-sec: În studiul nostru anterior 32, a fost generat ß 1-42 de tip sălbatic (UAS-WT42). UAS-GalT6, UAS-SAT1, UAS-GNE și UAS-sec: În acest studiu (descris mai jos) au fost generate Api- 40 E22Q (UAS-Dut40).
Construcția transgenelor
Construcția transgenului Aβ a fost descrisă anterior 32. Pe scurt, secvența Aβ a fost amplificată prin PCR din cADN-ul celulei HeLa și fuzionată cu peptida de semnal precursor proenkefalină-A 33, 34. Mutația Aβ olandeză (subliniată) a fost introdusă în secvența Aβ clonată prin amplificare PCR (Pfu ADN polimerază, Promega) împreună cu primeri: 5 'GTGTTCTTTGCACAAGATGTGGGTTCAA 3' (înainte) și 5 'TTGAACCCACATCTTGTGCAAAGAACzkkkk 3' (apoi) a fost (re) (re) .la vectorul pUAST 35 cu site-uri Bgl II.
Secvențele de codare ale GalT6, SAT1 și GNE umane au fost amplificate din ADNc din creierul uman (Takara), clonate în vectorul pCR-Blunt II-TOPO (Life Technologies) și apoi subclonate individual în site-urile EcoR I ale vectorului pUAST. S-au folosit următorii grunduri. Clonare GalT6: 5 'ATGTCTGTGCTCAGGCGGAT 3' (înainte) și 5 'CTTGCCACGACAGCCACTTC 3' (inversat); Clonare SAT1: 5 ′ CATTAGTATGCGGACGAAGG 3 ′ (înainte) și 5 ′ GCTCTCAGAGTTAGAGTTGC 3 ′ (inversat); Clonarea GNE: 5 ′ CATGGAGAAGAATGGAAATAACCGA 3 ′ (înainte) și 5 ′ CTAGTAGATCCTGCGTGTTG 3 ′ (invers). Fiecare transgen a fost injectat în embrioni albi galbeni și apoi încrucișați cu tulpina w 1118 .
Inducție GM3 și spectrometrie de masă
Muștelor adulte li s-a oferit accesul ad libitum la hârtia de filtru îmbibată în 10 mM acid N-acetilneuraminic (Neu5Ac, Sigma) în 150 mM zaharoză la fiecare două zile timp de o săptămână. Am observat că Neu5Ac este capturat de muște prin adăugarea de coloranți alimentari la soluția Neu5Ac (date neprezentate). Extracția lipidelor a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus 36. 200 până la 1000 de complexe de discuri larvare ale creierului și capete adulte adulte au fost îndepărtate de la muște, fiecare grup de organe a fost grupat individual și omogenizat în TBS (50 mM Tris-HCI, pH 7, 6, 150 mM NaCl) și omogenizații au fost evaporat. folosind un concentrator centrifugal (Tomy). Peletele au fost suspendate în cloroform: metanol 2: 1 (v/v) și centrifugate la 17.800 x g la 20 ° C timp de 2 minute. Cele două extracte de solvent au fost combinate și uscate la 42 ° C sub N2 gaz.
Western blots
Mulțumiri
Acest studiu a fost susținut de fondurile de cercetare pentru științele longevității (numerele de subvenții 25-19 pentru KY și 28-46 pentru LT) de la Centrul Național pentru Geriatrie și Gerontologie din Japonia.
Material suplimentar electronic
Informatii suplimentare
Comentarii
Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.