abstract

Principalul

Un număr de inhibitori puternici ai aromatazei au fost acum introduși pentru utilizare la femeile aflate în postmenopauză cu tumori mamare hormon dependente (Miller, 1999). În timp ce dezvoltarea lor reprezintă un avans semnificativ în terapiile disponibile pentru tratamentul femeilor cu cancer de sân, ratele de răspuns complet și parțial atunci când sunt utilizate ca tratament de linia a doua rămân relativ scăzute (10-20%) cu timpul până la progresia tumorii. relativ scurt (3-6 luni) (Santen și Harvey, 1999). Cu toate acestea, într-un studiu recent cu utilizarea adjuvantă a unui inhibitor de aromatază împotriva tamoxifenului, singur sau în combinație, supraviețuirea fără boală a fost semnificativ mai lungă la subiecții care au primit terapie cu inhibitori de aromatază (ATAC Trialist Group, 2002). În plus, o serie de reacții adverse adverse, inclusiv probleme gastro-intestinale, amețeli și greață, sunt asociate cu utilizarea unor inhibitori (Buzdar și colab., 1997). Utilizarea inhibitorilor de aromatază la femeile aflate în postmenopauză cu cancer de sân a avut, de asemenea, un efect advers asupra profilului lipidic seric (Elisaf și colab., 2001). Prin urmare, este necesar să se dezvolte noi metode de inhibare a activității aromatazei, care ar putea acționa în mod specific în sân, dar ar trebui să înlocuiască alte țesuturi sensibile la estrogen.

Fibroblastele derivate din țesuturile mamare normale sau maligne au fost utilizate ca model pentru a studia activitatea aromatazei, deoarece aceste celule au niveluri de activitate mult mai mari decât celulele epiteliale (Singh și colab., 1999). Folosind astfel de fibroblaste, au fost identificate o serie de citokine, inclusiv interleukina 6 (IL-6) și factorul de necroză tumorală (TNFα) ca regulatori importanți ai activității fibroblastelor aromatazice (Reed și colab., 1992; Macdiarmid și colab., 1994). Activitatea periferică a aromatazei este crescută la persoanele în vârstă și obeze (Grodin și colab., 1973; Hemsell și colab., 1974) și producția de IL-6 este, de asemenea, crescută în aceste condiții (Wei și colab., 1992; Mohamed-Ali și colab., 1997),

Capacitatea IL-6 de a stimula activitatea aromatazei în fibroblastele cultivate este semnificativ potențată (până la 21 de ori) de receptorul său solubil, IL-6sR (Singh și colab., 1995; Zhao și colab., 1995a, 1995b). IL-6 este produsă de fibroblaste derivate din țesuturile mamare normale și maligne, în timp ce IL-6sR a fost detectată numai în mediu condiționat obținut din fibroblaste maligne (Singh și colab., 1995). Multe tumori mamare sunt infiltrate de macrofage și limfocite și există dovezi că aceste celule pot fi o sursă majoră de factori capabili să stimuleze activitatea aromatazei în sân (Purohit și colab., 1995; Reed și Purohit, 1997).

La fel ca alte citokine, IL-6 acționează prin legarea la receptorul care acoperă membrana. Complexul IL-6R constă dintr-o subunitate de legare a ligandului cu greutăți moleculare de 80 kDa (gp80) și 130 kDa (gp130) de proteină de transducție a semnalului (Taga și colab., 1989; Kishimoto și colab., 1995). Subunitatea gp80, care poate exista și într-o formă solubilă (Rose-John și Heinrich, 1994), leagă IL-6 cu afinitate scăzută și trebuie să se asocieze cu gp130 mai mare pentru legarea cu afinitate ridicată și transducția semnalului. În timp ce anticorpii monoclonali IL-6 (Mabs) au fost utilizați pentru abrogarea efectelor IL-6, aceștia sunt doar parțial eficienți (Klein și colab., 1991). Maburile formează un complex cu IL-6, ducând la un clearance redus al citokinelor.

Ca o modalitate alternativă de a bloca acțiunea IL-6, Ciliberto și colegii săi au dezvoltat o serie de antagoniști ai receptorilor IL-6 care au fost forme mutante ale IL-6 care se pot lega de IL-6R, dar îl pot bloca într-o configurație inactivă ( Demartis și colab., 1996). Aceasta îi inhibă capacitatea de a interacționa cu proteina de transducție a semnalului gp130. Varianta IL-6 a Sant 7 a fost identificată drept cel mai puternic superantagonist și a fost capabilă să inhibe creșterea stimulată de IL-6 a mai multor tipuri diferite de celule maligne. Datorită rolului important pe care îl joacă IL-6 + IL-6sR în reglarea activității aromatazei, a fost investigată capacitatea Sant7 de a bloca activitatea aromatazei stimulată de citokine. Sant 7 a fost, de asemenea, utilizat pentru a obține informații suplimentare cu privire la procesul prin care PGE2 reglează activitatea aromatazei în fibroblastele derivate din țesutul mamar.

Materiale și metode

Cultura fibroblastelor

S-au prelevat probe de țesut adipos de la femei care au suferit mamoplastie redusă. În plus, femeile supuse lumpectomiei sau mastectomiei au fost prelevate probe pentru țesutul adipos în apropierea tumorilor mamare (adică a țesutului „neparticipant”) și a tumorilor mamare. Probele de țesut au fost obținute cu consimțământul informat de la subiecții aprobați de Comitetul de etică al spitalului.

Țesuturile rezecate au fost măcinate cu bisturiu și incubate în mediu esențial minim modificat Eagles (EMEM) timp de 18-24 ore la 37 ° C cu colagenază (200 μg ml-1). Celulele dispersate au fost colectate prin centrifugare și spălate de două ori cu mediu de îndepărtare a colagenazei. Celulele dispersate au fost însămânțate în baloane de cultură de 25 cm2 și lăsate să se atașeze. Celulele au fost crescute până la confluența în EMEM conținând tampon HEPES (20 mmol-1), 10% ser fetal de vițel (FCS) și suplimente (Reed și colab., 1992). Celulele au fost trecute în mod obișnuit de două până la trei ori, apoi însămânțate cu baloane de cultură de 25 cm2 și crescute până la confluența de 70-80%. Mediul a fost înlocuit cu 2% c. În acest mediu, dexametazona (100 nM) a fost adăugată în prezența dexametazonei (100 nM) timp de 48 de ore și a inclus: IL-6 + IL-6sR (50 și 100 ng ml-1, cercetare și dezvoltare). Systems Ltd, Abingdon, Oxon, Marea Britanie) și PGE2 (10 μM, Sigma, Poole, Dorset, Marea Britanie).

Sant 7

Superantagonistul IL-6R Sant 7 a fost obținut de la Sigma-Tau (Roma, Italia) și sintetizat așa cum s-a descris mai sus (Salvati și colab., 1995). Sant 7 a fost dizolvat în mediul de cultură înainte de adăugarea la celule.

Testul aromatazei

Activitatea aromatazei a fost măsurată în monostraturi intacte de fibroblaste folosind (1β - 3H) androstendionă (15-30 Ci mmol - 1, NEN - Du Pont, Stevenage, Herts, Marea Britanie) timp de 3 - 20 ore (Reed și colab., 1992). Pe scurt, monostratele de fibroblast au fost spălate o dată cu salina EM echilibrată a Earle (2,5 ml), cu excepția cazului în care se specifică altfel. S-a adăugat androstendionă 3H (0,25 μCi) la fiecare balon pentru a da o concentrație finală de substrat de 3 până la 4 nM. Monostratele de fibroblast au fost incubate cu substrat timp de 3 până la 20 de ore la 37 ° C, în funcție de activitatea aromatazei bazale din celule. Flacoanele care nu conțin celule au fost de asemenea incubate cu substrat și mediu fără ser sub formă de semifabricate. După incubare, o alicotă a mediului (2 ml) a fost îndepărtată din fiecare balon și alicotele au fost extrase de două ori cu dietil eter (5 ml), care a fost aruncat. Faza apoasă rămasă a fost tratată cu un volum egal de soluție conținând cărbune activ (5,0%) și dextran (0,5%), centrifugată și s-a luat o alicotă a supernatantului (1 ml) pentru a determina conținutul său radioactiv prin spectrometrie de scintilație lichidă. Până în prezent, activitatea aromatazei, măsurată în fibroblaste, sa dovedit a fi liniară în ceea ce privește timpul de până la 24 de ore (Macdiarmid și colab., 1994).

statistici

Semnificația diferențelor în activitatea aromatazei în celulele tratate și de control a fost evaluată utilizând testul t Student. Exemple reprezentative de rezultate sunt date pentru experimentele care au fost repetate de 2 până la 3 ori.

Rezultatul

Capacitatea Sant7 de a inhiba activitatea aromatazei stimulată de citokine a fost examinată inițial la fibroblastele derivate din țesutul adipos al sânului unui subiect supus unei mamoplastii reducătoare (Figura 1). La acești fibroblasti, IL-6 singur (la 50 ng ml-1) a crescut activitatea aromatazei cu 27%. Cu toate acestea, adăugarea de IL-6sR în combinație cu IL-6 și-a îmbunătățit semnificativ capacitatea de a stimula activitatea aromatazei (de 7,7 ori comparativ cu martorii). Sant 7 a cauzat semnificativ (P 1 (Figura 3).

inhibarea

Efectul superantagonistului receptorului IL-6, Sant7 asupra activității aromatazei stimulate de IL-6, IL-6sR sau IL-6 + IL-6sR în fibroblaste derivate din reducerea țesutului adipos mamoplastic. Fibroblastele au fost cultivate în 2% FCS dezbrăcat, EMEM fără fenol-roșu și adăugate în acest mediu timp de 48 de ore în prezența dexametazonei (100 nM). Activitatea aromatazei a fost măsurată în monostratele intacte de fibroblaste folosind [3H-ip] androstendion ca substrat. Semnificația diferențelor dintre celulele tratate și celulele martor a fost evaluată utilizând testul t Student (a, P

( A ) Efectul Sant7 asupra activității aromatazei stimulată de IL-6, IL-6sR sau IL-6 + IL-6sR în fibroblaste derivate din țesutul proximal tumorii mamare. Fibroblastele au fost cultivate în 2% FCS dezbrăcat, EMEM fără fenol-roșu și adăugate în acest mediu timp de 48 de ore în prezența dexametazonei (100 nM). Activitatea aromatazică a fost măsurată în monostraturi intacte folosind [3H-1β] androstendion ca substrat. Un set de celule (pretratament) a fost preincubat cu Sant 7 timp de 3 ore înainte de adăugarea IL-6 + IL-6sR, în timp ce pentru celălalt set (fără pretratare) Sant 7 a fost adăugat în același timp cu IL-6 + IL -6. 6sR (a, P

Răspunsul la doză la capacitatea Sant7 de a inhiba aromataza stimulată de IL-6 + IL-6sR în fibroblaste derivate din țesutul proximal de tumora mamară. Sant 7 a inhibat activitatea aromatazei stimulată cu un IC50 de 60 ng ml-1 (adică trei măsurători în care coeficienții de variație

Capacitatea Sant7 de a inhiba IL-6 + IL-6 sR stimularea activității aromatazei în fibroblaste derivate din țesut reducător mamoplastic. Celulele au fost tratate timp de 48 de ore cu IL-6 (50 ng ml-1), IL-6sR (100 ng ml-1) sau Sant7 (10 ug ml-1) sau în combinații așa cum se arată, în absența sau prezența dexametazonei (Dex, 100 nM). Activitatea aromatazei în celulele martor a fost de 1370 ± 15 fmol 20 h-1 106 celule -1 și 639 ± 35 fmol 20h -106 celule -1 pentru fibroblaste cultivate în absența sau prezența dexametazonei (medie ± sd, n = 3) a, P

( A ) Efectul Sant 7 asupra aromatazei stimulate de PGE2 în fibroblastele proximale. IL-6 (50 ng ml-1) + IL-6sR (100 ng ml-1) a stimulat activitatea aromatazei într-o măsură mai mare decât PGE2 (10 μM). Sant7, care blochează activitatea aromatazei stimulate de IL-6 + IL-6sR, a redus semnificativ capacitatea PEG2 de a stimula activitatea aromatazei în acești fibroblasti. Pentru a determina dacă efectele Sant 7 au fost reversibile (Rev), un set de fibroblaste (IL-6 + IL-6sR (Rev)) a fost preincubat cu Sant 7 timp de 12 ore și apoi Sant 7 a fost îndepărtat prin spălarea celulelor cu fosfat . - soluție salină tamponată. IL-6 + IL-6sR a stimulat activitatea aromatazei în aceste celule după spălarea într-o gamă similară de fibroblaste care nu au fost expuse la Sant 7, indicând faptul că Sant 7 nu acționează ireversibil. (a, P