- obiecte
- abstract
- introducere
- Rezultatul
- Compoziția clonală a grupului HSC datorită vârstei
- Inversarea funcțională a clonelor HSC vechi
- discuţie
- metode
- șoareci
- Analize imunofenotipice și sortare celulară
- Investigarea clonalității de îmbătrânire a HSC
- Derivarea celulelor iPS
- Generarea și caracterizarea clonelor șoarecilor himerici specifici
- statistici
- Disponibilitatea datelor
- Mai multe detalii
- Informatii suplimentare
- Fișiere PDF
- Informatii suplimentare
- Revedeți fișierul
- Fișiere Excel
- Informații suplimentare 1
- Comentarii
obiecte
- îmbătrânire
- hematopoieză
- Celulele stem hematopoietice
abstract
Îmbătrânirea este asociată cu modificări semnificative ale celulelor stem somatice/adulte, iar tratamentele pentru contracararea acestora ar putea avea beneficii semnificative pentru sănătate. În sânge, îmbătrânirea celulelor stem hematopoietice (HSC) este asociată cu mai multe deficiențe funcționale. Cu toate acestea, pe lângă constatarea recentă că HSC-urile individuale pot fi presetate diferit de la o vârstă fragedă, HSC-urile pot îmbătrâni și asincron. Evaluarea perspectivelor de întinerire a HSC necesită, prin urmare, în cele din urmă o abordare a acelor HSC care sunt afectate funcțional de vârstă. Aici combinăm codurile de bare genetice ale șoarecilor vechi HSC cu formarea celulelor stem pluripotente induse (iPS). Acest lucru ne permite să vizăm în mod specific HSC mai vechi, care prezintă linii oblice marcate, care sunt un semn distinctiv al îmbătrânirii HSC. Evaluările funcționale și moleculare arată că hematopoieza din aceste clone iPS nu se distinge de cea asociată cu șoarecii tineri. Datele noastre oferă astfel sprijin direct pentru ideea că mai multe atribute funcționale cheie ale îmbătrânirii HSC pot fi inversate.
Îmbătrânirea este asociată cu o predispoziție profundă la o serie de boli, care includ o prevalență mai mare de anemie, leucemie și imunitate afectată în sânge 1. În timp ce bolile legate de vârstă pot părea a fi cauzate de modificări care compromit sau modifică funcția celulelor efectoare mature, ele sunt mai dificil de reconciliat cu organe precum sângele, care se bazează pe celule efectoare de viață inerentă care necesită reaprovizionare continuă 1. 2, 3. Mai degrabă, datele colectate sugerează că producția de novo a subclaselor de celule hematopoietice se schimbă odată cu vârsta de 4, 5, 6, 7, similar cu ferestrele de timp mai înguste din dezvoltarea inițială 8. Aceste descoperiri au provocat, de asemenea, în mare măsură criteriile de definire clasică a celulelor stem hematopoietice (HSC) ca populație omogenă de celule cu capacitate de diferențiere pentru toate liniile hematopoietice. Mai degrabă, capacitatea diferențială a HSC poate fi definită mai adecvat ca o ieșire hematopoietică continuă cu mai multe camere, care, totuși, nu poate implica neapărat producerea tuturor tipurilor de celule sanguine în toate momentele.
În timp ce multe dintre modificările îmbătrânirii adulților sunt atribuite schimbărilor funcției HSC 1, componentele individuale ale grupului HSC pot prezenta o schimbare semnificativă a funcției 4, 9, 10. Pe lângă faptul că diferitele HSC sunt presetate diferit 5, 6, 11, ceea ce ar putea schimba treptat compoziția grupului HSC odată cu vârsta de 5, 6 ani, alte mecanisme care duc la schimbări segmentare în cadrul grupului HSC, inclusiv impactul asupra mediului, multiplicarea și recuperarea neuniformă Mutațiile ADN din celulele individuale sunt, de asemenea, posibile. Astfel, eterogenitatea celulelor individuale nu este luată în considerare doar prin evaluarea populațiilor de celule vechi cronologic.
Mecanismele care determină îmbătrânirea atât la nivelul organismului, cât și la nivelul celulei au atras o atenție semnificativă, deoarece acestea sunt principalele ținte pentru intervenție. De exemplu, sănătatea și longevitatea prelungite au fost raportate în diferite organisme model prin restricție calorică și/sau manipulare a axelor IGF1 și mTOR 3. În plus, funcția crescută a celulelor vechi a fost propusă prin factori sistemici „tineri ”12. Nu este clar dacă aceste abordări reflectă de fapt întinerirea la nivel celular sau mai degrabă stimulează celule mai puțin afectate de vârstă. Această preocupare se aplică și studiilor anterioare care abordează perspectivele inversării îmbătrânirii celulare prin reprogramarea celulelor somatice 13, 14, 15, care de obicei nu au reușit să facă distincția între celulele vechi funcțional și cronologic. În acest scop, este necesar să se definească în mod fiabil funcția celulei donatoare parentale specifice utilizate pentru reprogramare, care necesită evaluare la nivel celular clonal/individual.
Aici abordăm aceste probleme prin codarea în bare genetice a HSC tineri și bătrâni, care permite evaluarea capacității lor regenerative după transplant la nivel clonal. Acest lucru ne permite să constatăm că îmbătrânirea este asociată cu o scădere a clonelor HSC potențiale limfoide și o creștere a clonelor potențiale mieloide. Producem linii stem pluripotente induse (iPS) din clone vechi HSC definite funcțional, pe care le evaluăm în continuare în ceea ce privește capacitatea lor de a forma sânge după re-diferențiere la HSC prin complementare blastocist/morula. Experimentele noastre arată că toate clonele iPS testate, inclusiv cele care inițial erau complet lipsite de potențialul celulelor T și/sau B, funcționează similar cu HSC-urile tinere (1 ° himere), deși sunt forțate să regenereze hematopoieza limfomieloidă în transplanturi secundare. Această funcție coincide din nou cu proprietățile transcripționale partajate cu HSC-uri tinere, nu vechi. Prin urmare, oferim sprijin direct pentru ideea că mai multe aspecte funcționale ale îmbătrânirii HSC pot fi inversate.
Rezultatul
Compoziția clonală a grupului HSC datorită vârstei
În etapele 1 și 2, HSC-urile tinere și cele mai în vârstă au fost izolate, codate în bare și transplantate competitiv în gazde tinere iradiate letal. După determinarea și evaluarea hematopoiezei pe termen lung care contribuie din celulele codificate în linie (etapa 3a), celulele B, T și mieloide periferice, precum și progenitorii celulelor eritroide BM au fost izolate și supuse unei secvențieri aprofundate pentru a rupe codurile de bare de bază ( pasul 3b).). În același timp, celulele BM imature au fost izolate de la șoareci transplantați cu coduri de bare HSC vechi (1 ° transplant), cărora le lipsește complet reconstituirea celulelor T (producția redusă de celule T este un semn distinctiv al îmbătrânirii HSC). Codurile de bare din liniile iPS obținute au fost examinate pentru a se suprapune cu potențialul liniilor HSC individuale obținute în etapa 3a. Apoi, cinci linii iPS au fost folosite pentru a genera himere iPS prin completarea blastocisturilor și a morulei, ale căror coduri de bare sunt asociate cu liniile mieloide de șanfrenare (pasul 4). HSC-urile din himera iPS au fost examinate pentru parametrii funcționali și moleculari ai formării sângelui, iar performanța lor a fost comparată cu tinerii (teste funcționale și moleculare), vârsta mijlocie (teste moleculare) și HSC-urile vechi (teste moleculare; etapa 5).
Imagine la dimensiune completă
A ) Generarea de celule T periferice din HSC-uri cu coduri de bare în 1 ° transplanturi, himere iPS și 2 ° transplanturi. Se arată frecvența medie (%) ± sd între toate celulele testate (n = 5 și 22 de șoareci pentru transplanturi iPS, respectiv, 2 °). Celulele din graficele FACS sunt pregandite pe celule CD45.2 +, GFP +, CD11b unice, viabile și pe celule blastociste CD45.2 +, CD11b (himere iPS) și transplanturi de 2 °. b ) generarea de celule T în himerele iPS de cimbru și în transplanturi de 2 °. Frecvența medie (%) ± sd a CD4 - CD8-, CD4 + CD8-, CD4 + CD8 + și CD4 - CD8 + dintre toate timocitele CD3 + derivate din celulele testate este indicată în porțile corespunzătoare. Celulele sunt ecranate pe linii unice, viabile -, CD3e +, CD45.1 +/CD45.2 + pentru controale tinere și celule CD45.2 + iPS derivate. Datele provin dintr-un experiment (himere primare și secundare) pentru fiecare linie iPS.
Imagine la dimensiune completă
Tabel în dimensiune completă
Pentru a evalua potențialul de repopulare hematopoietică a celulelor derivate din iPS, am transplantat celule BM din blastocist/morula himeră în gazde iradiate letal (Fig. 1, transplant 2 °). Datorită amestecului de iPS derivat și endogen în himerele primare, aceste experimente sunt de natură competitivă. Acest lucru a arătat că atât cantitativ (niveluri de celule derivate de donator), cât și calitativ (contribuția la fiecare linie evaluată) din fiecare dintre HSC-uri derivate de la iPS (iPS-HSC) au fost similare cu HSC-urile de control endogene (tinere) (Tabelul 1). Deoarece HSC-urile parentale sunt complet absente în linia de celule T (Figurile 2f și 3a), ne-am completat examinările cu o analiză mai detaliată a dezvoltării celulelor T în iPS și 2 ° timini de transplant (Figura 3). Acest lucru a dezvăluit frecvențe comparabile ale celulelor CD3 + CD4 - CD8-, CD3 + CD4 + CD8 +, CD3 + CD4 + CD8- și CD3 + CD4 - CD8 + cu celule de control endogene (tinere) (Fig. 3b) și verificate pentru re persistente - determinarea competenței celulelor T din celulele donatoare parentale incompetente cu celulele T.
Imagine la dimensiune completă
discuţie
Majoritatea organelor conțin populații de celule stem adulte/somatice care funcționează pentru a menține homeostazia pe viață. Având în vedere dovezile crescânde că celulele stem adulte nu sunt scutite de îmbătrânire, pare rezonabil că scăderea extinsă a funcției țesuturilor odată cu vârsta se datorează funcției modificate a celulelor stem asociate acestora. În același timp, fiecare grup de celule stem îmbătrânite ar trebui considerate potențial eterogene; fie pentru că celulele stem individuale pot fi presetate diferit de la o vârstă fragedă, diferitele experiențe întâlnite de ontogeneza eliberării individuale a celulelor stem, fie o combinație a acestor fapte. Prin urmare, atunci când se examinează perspectivele de inversare a îmbătrânirii celulare, este crucial să existe o abordare funcțională, spre deosebire de celulele vechi cronologic.
metode
Șoareci Rosa26 rtTA; Col1a1 4F2A (șoareci 4F2A) a fost furnizat cu amabilitate de Dr. Rudolf Jaenisch și au fost obținute prin laboratorul lui Jackson (numărul depozitului 011004). Celulele acestor șoareci exprimă oct4, Klf4, Myc și Sox2 după suplimentarea cu doxiciclină 22. Toți șoarecii aveau fundalul C57BL/6 și aveau o combinație de markeri congenici CD45.1, CD45.2 sau F1CD45.1 x CD45.2. Animalele au fost găzduite în facilități pentru animale de la Universitatea Lund și Universitatea din Copenhaga. Toate experimentele pe animale au fost efectuate cu aprobarea comitetelor locale de etică. Atât șoarecii masculi, cât și femelele au fost folosiți pentru experimente.
Analize imunofenotipice și sortare celulară
Investigarea clonalității de îmbătrânire a HSC
Derivarea celulelor iPS
Generarea și caracterizarea clonelor șoarecilor himerici specifici
himere iPS. Clonele iPS selectate (inițial CD45.2 +) au fost injectate în morula și blastociste de la șoareci CD45.1 + /.2 + într-o instalație de șoarece transgenic de bază (Universitatea din Copenhaga, Danemarca). Chimerele rezultate au fost examinate pentru culoarea stratului de agouti, prin PCR împotriva unui cod de bare specific și prezența celulelor CD45.2 + pozitive în PB. La vârsta de 11-14 săptămâni, șoarecii himerici au fost sacrificați și BM, PB și cimbru au fost colectați pentru analiză și sortare după FACS.
2 ° transplant. Pentru a examina competitivitatea HSC-urilor derivate de la iPS, șoarecii CD45.1 + sau CD45.1 + /.2 + F1 cu vârsta de 8 până la 14 săptămâni letali iradiați (950 cGy) au fost transplantați cu 2 x 106 celule BM nefracționate din fiecare himeră iPS. Reconstituirea în mai multe linii a fost evaluată în mod regulat de către FACS PB.
Pentru a examina similitudinea moleculară a HSC-urilor derivate de la iPS cu HSC-urile de diferite vârste cronologice, am selectat mai întâi 3 gene legate de HSC extrem de exprimate, 3 gene de referință (Actb, Hprt și Gapdh) și 42 de gene exprimate diferențial în HSC datorită vârstei . A doua categorie a fost obținută prin analiza datelor de microcip publicate anterior asupra HSC-urilor în stare de echilibru pentru tineri și vârstnici (șase câmpuri pe vârstă). Datele au fost preprocesate prin extragerea valorilor de exprimare a nivelului sondei folosind RMA 25 și analizate în continuare folosind dChip 26 prin filtrarea sondelor cu o expresie mai mică de 50 în toate subseturile pentru a elimina zgomotul și cu o expresie diferențială mai mică de 1,5 ori. Apoi, gene reglate în sus și în jos au fost utilizate ca seturi de gene pentru o analiză de îmbogățire a setului de gene 27 ale matricilor HSC tinere și în vârstă în stare de echilibru și 42 de gene au fost selectate din listele de gene de vârf ale acestor analize.