determină

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Reducerea volumului de alimente determină o schimbare de fază în orele periferice
  • Frecvențele meselor cu aceleași intervale de masă nu afectează faza de ceas periferic
  • Modelele alimentare care imită dietele umane modifică fazele ceasului periferic
  • discuţie
  • metode
  • fiară
  • Protocol de monitorizare in vivo
  • Analiza datelor de monitorizare in vivo
  • Protocol de hrănire planificat
  • analize statistice
  • Comentarii

obiecte

  • Expresia genelor
  • Reglarea genelor
  • imagistică
  • fiziologie

abstract

Ceasul circadian periferic la mamifere este puternic antrenat de cicluri de lumină-întuneric și de mâncare. Funcțiile lor fiziologice sunt menținute prin sincronizarea fazelor organelor folosind modele de expresie genică pentru ceasuri. Cu toate acestea, se știe puțin despre adaptarea ceasurilor periferice la momentul mesei de mai multe zile. Aici, am examinat efectul obiceiurilor alimentare neregulate în termeni de sincronizare și volum asupra orelor lor periferice in vivo. Am constatat că faza ceasului periferic a fost modificată de cantitatea de hrană și de intervalul dintre timpii de hrănire, dar nu a fost afectată de frecvența hrănirii atâta timp cât intervalul a rămas fix. În plus, rezultatele noastre sugerează că masa târzie ar trebui împărțită în două demipensiuni pentru a atenua efectul fazelor neregulate ale ceasului periferic.

Sistemul de ceas circadian joacă un rol cheie în menținerea endogenă a funcțiilor fiziologice, inclusiv ciclul somn-veghe, temperatura corpului, metabolismul și funcția organelor 1. Sistemele de ceasuri ale mamiferelor includ gene de ceas; în special, perioada 2 (Per2) reprezintă o buclă de feedback transcripțională și translațională care, împreună cu ceasul, BmaI și Cry1, generează ritmuri de 24 de ore de niveluri de ARN și proteine ​​la nivelul unei singure celule. Acest sistem este activ nu numai în nucleul suprachiasmatic (SCN), oscilatorul central al sistemului de ceas circadian al mamiferelor, ci și în corpul 1, 2, 3. Analiza microarrays-urilor temporale în țesuturile hepatice a arătat că aproximativ 10% din toate genele prezintă diferențe în expresia zilei și a nopții, sugerând că ritmul evenimentelor fiziologice este reglementat de sistemul de ceas circadian. .

Utilizarea experimentelor planificate de hrănire a șoarecilor pentru a investiga eliminarea fazelor ritmurilor comportamentale și fiziologice, precum și a ritmurilor de expresie a genelor ceasului sugerează că alimentele sunt un factor puternic de antrenare pentru ceasurile periferice 1, 3. Această antrenare este independentă de SCN, așa cum sa raportat în studiul leziunii SCN 17. Ceasul hepatic este ușor preluat de alimente prin factori nutriționali sau metabolici, cum ar fi carbohidrații, aminoacizii 18 și insulina 19. Am raportat anterior că aportul de alimente sau injecția de insulină mărește acut reglarea Per2 și reglează în jos expresia genei Rev-erbα în ficat 19. Eticheta de mâncare diferă de urmele de lumină prin faptul că corpul primește semnale de alimentare ca semnale de impuls non-parametrice, cum ar fi micul dejun, prânzul și cina, în timp ce ritmurile dependente de SCN sunt captate de semnale luminoase parametrice și neparametrice. .

Pe baza acestor fapte, scopul nostru în acest studiu a fost de a afla cum impulsurile individuale de alimente stimulează ceasul periferic în timpul zilei și cum faza ceasului periferic este reglementată de mai multe mese. Aici, am folosit o metodă in vivo introdusă recent pentru a monitoriza ceasurile periferice pentru a determina modul în care obiceiurile alimentare similare cu cele de la oameni determină fazele ceasului periferic la șoareci.

Rezultatul

Reducerea volumului de alimente determină o schimbare de fază în orele periferice

În studiile la om, paradigma circadiană fără nutriție este, în general, utilizată pentru a reduce antrenamentul indus de alimente 21; prin urmare, am folosit această paradigmă în experimentul nostru, oferind mai întâi șoarecilor 6 mese pe zi la intervale regulate. Astfel, am examinat efectul volumului de alimente asupra fazei ceasului periferic folosind acest program, în care același volum de alimente a fost servit de fiecare dată folosind un sistem de alimentare automatizat la domiciliu 22. Pentru a evita reziduurile în timpul perioadei de hrănire, șoarecii au fost ușor limitați în calorii în acest experiment. Folosind tehnica descrisă anterior 23, am folosit șoareci knock-in PER2: LUCIFERASE (PER2: LUC) pentru a măsura activitatea Per2 în țesuturile periferice prin imagistica in vivo a pielii (Figurile 1A și B). În condițiile de hrănire, după cum este necesar, activitatea PER2: LUC în țesuturile periferice (rinichi, ficat și glanda submandibulară) a fost cea mai mare în jurul timpului Zeitgger 19 (ZT 19; ZT 0 indică ora la care s-au aprins luminile; Figura 1B). a constatat că 20%, dar nu 10%, restricția de hrănire, după cum este necesar, a fost suficientă pentru a determina șoarecii să-și consume toate dietele într-un interval de 4 ore de hrănire. La șapte zile după începerea acestui protocol de hrănire, șoarecii au putut mânca toate alimentele livrate în termen de 3 minute de la sosirea alimentelor.

Planuri schematice de hrănire (stânga) și faze medii ale vârfului PER2: LUC al fiecărui organ pentru fiecare stare de hrănire (dreapta). Barele albe și negre de pe axa orizontală indică condiții de lumină și întuneric de 12 ore. Cercurile albe indică timpii de hrănire, iar dimensiunea cercului este legată de volumul de alimente. Toate mesele au fost distribuite uniform pe parcursul zilei și volumul fiecărei mese pe parcursul zilei în grup a fost echivalent; numărul de hrană a fost de 6, 4, 3 sau 2 mese pe zi. Orele periferice au fost monitorizate după 2 săptămâni de obișnuință cu fiecare stare de hrănire. Datele sunt prezentate ca medie ± SEM, cu n = 6 șoareci per afecțiune. ANOVA unidirecțional nu a prezentat diferențe semnificative în niciunul dintre țesuturile testate. Sub Gla, glanda submandibulară; ZT, timpul lui Zeitgeber.

Imagine la dimensiune completă

Modelele alimentare care imită dietele umane modifică fazele ceasului periferic

Pentru a imita obiceiurile alimentare umane, ne-am concentrat asupra stării în care șoarecii au primit 3 mese pe zi. Am examinat mai întâi diferitele puncte de timp la care a fost servită mâncarea, adică ZT 12, 18 și 0 sau ZT 0, 6 și 12, pentru a înțelege diferența dintre programul de hrănire de zi (ZT 6) și de noapte (ZT 18) (Figura 3A) . Fazele de ceas periferic induse prin hrănirea la ZT 0, 6 și 12 au diferit semnificativ de fazele induse de hrănirea la ZT 12, 18 și 0. În plus, faza de ceas periferic a șoarecilor hrăniți cu 3 mese la ZT 12, 18, și 0 a fost similar cu faza șoarecilor hrăniți ad libitum (Figurile 1 și 3A).

Planuri schematice de hrănire (stânga) și faze de vârf PER2: LUC medii pentru fiecare organ în condiții de hrănire (dreapta, medie ± SEM). Barele albe și negre de pe axa orizontală indică condiții de lumină și întuneric de 12 ore. Cercurile albe indică timpii de hrănire, iar dimensiunea cercului este legată de volumul de alimente. Săgețile indică timpii de hrănire care au urmat cel mai lung interval de hrănire pentru fiecare afecțiune. Orele periferice au fost monitorizate după 2 săptămâni de obișnuință cu fiecare stare de hrănire. (A) faza de ceas periferic la șoareci hrăniți cu 3 mese distribuite uniform pe tot parcursul zilei și nopții; mâncarea a fost administrată la ZT 0, 6 și 12 (a) sau la ZT 12, 18 și 24 (b); n = 6 șoareci per afecțiune. * p 24; prin urmare, momentul mesei a fost întârziat în acest studiu. Mărimea meselor a fost următoarea: micul dejun, 0,9 g (27% din volumul total de alimente); prânz, 1,2 g (36%); iar cina, 1,2 g (36%). În Figura 3B, faza ceasului periferic atunci când este controlată de programul de alimentare ZT 12, 17 și 1 a fost similară fazei când a fost urmată de programul de alimentare ZT 12, 18 și 0. Cu toate acestea, ZT 12, 17, 3 sau 4 schema de hrănire a provocat o schimbare dramatică de fază.orele periferice la o fază similară cu cea observată în schema de hrănire ZT 0, 6 și 12.

În al treilea rând, am împărțit volumul de alimente servite la ZT 4 în jumătate din volumele servite la ZT 0 și ZT 4 pentru a anula efectele fazei mesei târzii. După analizarea orelor periferice în conformitate cu programul de hrănire ZT 12, 17 și 4, am schimbat regimul de hrănire a aceluiași șoareci în programul de hrănire ZT 12, 17, 0 și 4. La două săptămâni după schimbarea la noul program, ceasurile periferice au fost ușor deplasate înapoi pentru rinichi și ficat și s-au deplasat semnificativ înapoi pentru glanda submandibulară comparativ cu programul de hrănire anterior, adică ZT 12, 17 și 4. Acest lucru înseamnă că a zecea înainte de seara târziu poate proteja împotriva defazării ceas periferic.

discuţie

În studiul de față, am examinat funcția in vivo a ceasurilor periferice la șoareci expuși la mai multe regimuri de hrănire care au fost concepute pentru a imita obiceiurile alimentare umane. În primul rând, am constatat că ceasul periferic este o fază avansată după o reducere a aportului de alimente (Figura 1) și, în al doilea rând, că semnalul alimentar primit după un post lung este un factor puternic în determinarea fazei ceasului periferic (Figurile 2 și 3).

Mendoza și colab. 25 au arătat anterior că aportul total de alimente redus, inclusiv 6 mese pe zi, a provocat o schimbare de fază nu numai în ritmurile activității locomotorii, ci și în modelele de expresie a genelor de ceas din SCN. Acest efect secvențial de fază în SCN poate fi responsabil pentru modificările ceasurilor periferice de fază observate în acest studiu (Figura 1). De asemenea, am constatat că restricția calorică afectează progresul diferit în diferite organe. Rinichii au prezentat un răspuns mai puternic decât celelalte țesuturi monitorizate (Figurile 1D, 2 și 3). Mecanismul care stă la baza acestei faze de restricție calorică este încă necunoscut. O posibilitate este că modificările dependente de glucoză din sânge în activitatea AMPK pot modifica perioada de ceas periferică 9 și că activitatea AMPK poate fi specifică țesutului. Cu toate acestea, deoarece există multe căi de semnalizare implicate în antrenarea ceasului periferic 3, sunt necesare cercetări suplimentare cu privire la efectele stimulării alimentelor în diferite organe.

Fazele ceasului periferic nu au fost afectate de frecvențe diferite de hrănire (2, 3, 4 și 6 mese pe zi) atunci când hrănirea a fost efectuată la aceleași intervale, în timp ce s-au observat modificări clare de fază atunci când 3 mese au fost servite la intervale inegale pe zi (Figura) . 2 și 3). Acest rezultat poate fi explicat luând în considerare lungimea intervalului dintre punctele de timp de hrănire în fiecare stare de hrănire. Mâncarea furnizată după o perioadă lungă de post (indicată de săgețile din Figura 3) este deosebit de puternică la resetarea ceasului periferic. Am demonstrat anterior rezultate similare în ritmul hepatic PER2: LUC atunci când au fost hrăniți 2 mese pe zi, așa cum a fost evaluat ex vivo prin cultura de țesut 22; Este clar că efectul intervalelor de mâncare este puternic chiar și la șoarecii hrăniți cu trei mese pe zi în timpul unui ciclu normal de lumină-întuneric.

În concluzie, integrarea semnalelor din regimuri de dozare multiple determină vârful unic zilnic al ritmurilor de expresie a genei ceasului periferic in vivo. Această adaptare a ceasului periferic depinde de cantitatea de alimente și de intervalul dintre timpii de hrănire, chiar și cu un ciclu normal de lumină-întuneric. Rezultatele noastre sugerează, așadar, că obiceiurile alimentare ale oamenilor din societatea modernă s-au schimbat pentru a provoca faze neregulate ale orelor periferice. Cu toate acestea, rezultatele noastre sugerează, de asemenea, că ceasurile periferice neregulate pot fi ușor modificate prin reglarea obiceiurilor alimentare.

metode

Toate animalele au fost crescute și utilizate cu permisiunea Comitetului pentru experimente pe animale de la Facultatea de Științe și Tehnologie a Universității Waseda (permisiunea 2011-A49) și în conformitate cu Legea (nr. 105) și notificarea (nr. 6) a Guvernul japonez. Aceste studii au fost aprobate de Școala de Știință și Tehnologie de la Universitatea Waseda.

Șoarecii homozigoti PER2: LUC, cu un fundal mixt de C57/BL6J și ICR (albino), au fost încrucișați de mai mult de 5 ori cu șoareci PER2: LUC C57/BL6J 35 (șoareci C57/BL6J datorită dr. Joseph Takahashi, Northwestern University, Evanston, IL, SUA) și șoareci ICR (Tokyo Laboratory Animals). Șoarecii au fost menținuți pe un ciclu de lumină-întuneric (12 ore de lumină și 12 ore de întuneric, cu lumini aprinse la 8:00), la temperatura camerei de 23 ° C ± 1 ° C, umiditate de 60% ± 5% și intensitatea luminii de 100 - 150 lux la nivelul coliviei. Înainte de experimente, li s-a furnizat hrană standard (MF; Oriental Yeast Co. Ltd., Tokyo, Japonia) și apă ad libitum. Șoarecii masculi (vârsta: 10-12 săptămâni) adăpostiți individual au fost folosiți în acest experiment. Șoarecii au fost împărțiți în 3 grupuri, care au fost apoi expuși la diferite programe de hrănire, urmate de monitorizarea in vivo a ritmurilor ceasului periferic.

Protocol de monitorizare in vivo

Monitorizarea in vivo a fost efectuată așa cum s-a descris mai sus 23. Sistemul cinetic IVIS (Caliper Life Sciences, MA, SUA și Summit Pharmaceuticals International Corporation, Tokyo, Japonia) a fost utilizat pentru imagistica in vivo. Șoarecii au fost anesteziați cu izofluran (Mylan Inc., Tokyo, Japonia) și oxigen concentrat (SO-005B, Sanyo Electronic Industries Co. Ltd, Okayama, Japonia) folosind un sistem de anestezie cu gaze (XGI-8, Caliper Life Sciences), în interiorul unui cutie neagră. Când șoarecii au fost anesteziați, li s-a injectat sare de potasiu D-luciferină (Promega, Madison, WI, SUA) sc pe spate, lângă gât, la o doză de 15 mg/kg (30 mg/10 ml, 0,05). ml/10 g greutate corporală). Imaginile au fost apoi realizate la 6 minute și 8 minute după injectarea luciferinei în poziția dorsală pentru rinichi și la 10 minute și 12 minute după injectare în poziția ventrală pentru ficat și glanda submandibulară; imaginile au fost realizate folosind un timp de expunere de 1 min. Datele după 6 minute și 12 minute au fost obținute ca date de rezervă pentru datele obținute după 8 și 10 minute. Pentru fiecare punct de timp, imaginea bioluminiscentă a fost apoi îmbinată cu imaginea la scară de gri.

Imaginile au fost obținute de 6 ori pe zi (ZT 11, 15, 19, 23, 3 și 7). Șoarecii s-au întors în cuștile de acasă după fiecare procedură de imagistică și s-au recuperat rapid din anestezia cu izofluran. Timpul total sub anestezie cu izofluran a fost de aproximativ 20 de minute pe experiment. O analiză de patru ore a anesteziei și bioluminescenței pe zi nu a afectat activitatea luciferazei în țesutul periferic sau comportamentul 23 .

Analiza datelor de monitorizare in vivo

Datele de monitorizare in vivo au fost analizate așa cum s-a descris anterior 23. Bioluminiscența emisă din fiecare organ (rinichi, ficat și glandă submandibulară) a fost calculată automat folosind software-ul Living Image 3.2 (Caliper Life Sciences). Pentru fiecare organ, regiunea de interes (ROI) a fost setată la aceeași formă și dimensiune în timpul tuturor experimentelor. Pentru rinichi, datele despre rinichiul drept și stâng au fost calculate înainte de analiză. Valoarea medie a fotonului/s a ​​datelor din cele 6 puncte de timp pentru fiecare zi a fost desemnată ca fiind 100%, iar ritmul bioluminiscent pentru întreaga zi a fost exprimat ca procent din fiecare set de 6 puncte de timp pentru fiecare organ. Faza de vârf și amplitudinea acestor date% normalizate au fost determinate folosind un program simplu de procedură cosinor (Acro.exe, versiunea 3.5; proiectat de Dr. Refinetti 36).

Protocol de hrănire planificat

În cazul experimentului de hrănire programat, toți șoarecii au fost adăpostiți individual în cuști separate care conțin dozatoare de alimente (Pellet Dispenser 45 MG; Med-Associates, St. Albans, VT) pentru a livra pelete alimentare (45 MG, dietă purificată de rozătoare, BIO- SERV). ) așa cum este reglementat de temporizatorul 22; fiecare dintre aceste mese avea același volum de mâncare.

Șoarecii au fost împărțiți în 3 grupuri și hrăniți cu 20%, 25% sau 40% prin limitarea cantității de alimente consumate de șoarecii hrăniți liber: 20%, 3, 24 g sau 72 de pelete; 25%, 2,7 g sau 60 de pelete; și 40%, 2, 43 g sau 54 de pelete pe zi. La 20% restricție alimentară, la 6 mese pe zi, șoarecii au mâncat cel puțin 3 minute la fiecare moment 1 săptămână după hrănirea cu dieta; acest lucru a fost determinat de monitorizarea video a unui mouse reprezentativ. Datele furnizate în Figura 1 se referă la rezultatele obținute atunci când șoarecii au fost hrăniți cu 6 mese pe zi, la ZT 0, 4, 8, 12, 16 și 20. În experimentele ulterioare, am folosit o restricție alimentară de 20% pe zi. Pentru a imita obiceiurile alimentare umane, 0,9 g (27% din volumul total zilnic de hrană) au fost furnizate pentru micul dejun în ZT 12. În ZT 17 am furnizat 1, 2 g (36%) de mâncare pentru prânz și în ZT 1, 3 sau 4 pentru cină (Figurile 3B și C). În toate experimentele, ceasurile periferice au fost monitorizate la numai 2 săptămâni după începerea fiecărei condiții de hrănire.

analize statistice

Datele sunt exprimate ca mijloace ± SEM. Pentru analiza statistică au fost utilizate analiza unică a varianței (ANOVA), testul Tukey-Kramer sau testele t ale Studentului nepereche sau împerecheate. Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul StatView (versiunea Windows 5.0, SAS Institute).

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.