• abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Peptida de soia a suprimat tumorogeneza mamară indusă de DMBA
  • Peptida de soia a suprimat expresia proteinelor HSP90 și NF-kB in vivo
  • Apoptoza indusă de peptida de soia în celulele cancerului de sân uman
  • discuţie
  • metode
  • fiară
  • Pregătirea dietei și prepararea peptidei de soia
  • Modelul tumorigenezei mamare
  • Analiza microcipului
  • Analiza imunoblot și testul colorimetric al activității caspazei-3
  • imunohistochimie
  • Cultura celulară și testul MTT
  • Testele de apoptoză
  • analize statistice
  • glosar

abstract

În timpul carcinogenezei, NF-κB mediază procesele asociate cu dereglarea controlului normal al proliferării, angiogenezei și metastazelor. Astfel, suprimarea NF-κB este asociată cu chimioprevenția cancerului. Descoperirile colective indică faptul că proteina de șoc termic 90 (HSP90) este o chaperonă moleculară și face parte din complexul kinazei IκB (IKK), care joacă un rol central în activarea NF-κB. HSP90 stabilizează, de asemenea, proteinele cheie implicate în controlul ciclului celular și semnalizarea apoptozei. Am investigat dacă administrarea exogenă de peptidă de soia sărăcită cu izoflavonă a împiedicat tumorigeneză de șobolan indusă de 7,12-dimetilbenz [a] antracen (DMBA) la șobolan și am investigat mecanismul de acțiune. Administrarea dietetică de peptidă de soia (3,3 g/șobolan/zi) a redus semnificativ incidența carcinoamelor ductale (50%), numărul de tumori pe șobolani multipli purtători de tumori (49%; P

fără

Proiectarea experimentală a tumorigenezei indusă de DMBA a glandei mamare de șobolan. Trei grupuri de șobolani femele Sprague Dawley în vârstă de 4 săptămâni au fost hrăniți cu o dietă de control sau cu o dietă peptidică din soia timp de 4 săptămâni înainte de administrarea DMBA. Fiecare dietă a continuat din săptămâna 9 până la sfârșitul experimentului. Fiecare grup a fost format din 12 șobolani. Dieta de control + administrarea uleiului de susan; Dieta de control + administrarea DMBA; Dieta peptidică din soia + administrare DMBA.

Imagine la dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Peptida de soia suprimă expresia proteinelor NF-kB și HSP90 in vivo. (A) Colorare imunohistochimică reprezentativă a țesutului tumorii mamare din dieta de control + DMBA și peptidă de soia + grup DMBA. Colorarea imunohistochimică pentru proteinele HSP90 și NF-kB (p65) a arătat o colorare pozitivă puternică în carcinomul ductal din dieta de control + grup DMBA (panoul din stânga), în timp ce colorarea foarte slabă a fiecărei proteine ​​din peptida de soia + grupul DMBA (panoul din dreapta), mărire inițială, 400 ×. (B) Efectul peptidei de soia asupra expresiei proteinelor asociate apoptozei. Extractul de țesut integral preparat din țesutul mamar obținut de la animale din fiecare grupă a fost analizat prin analiza Western blot cu anticorpul indicat așa cum este descris în proceduri. Β-actina a fost utilizată ca control al încărcării. (C) Peptida de soia + grupul DMBA crește activitatea caspazei-3. Activitatea Caspase-3 a fost testată utilizând substrat DEVD cu lizate de țesut integral preparate dintr-o dietă de control + tumori DMBA sau peptidă de soia + DMBA.

Imagine la dimensiune completă

Apoptoza indusă de peptida de soia în celulele cancerului de sân uman

Pentru a examina dacă peptida de soia a suprimat creșterea celulelor cancerului de sân uman, celulele MCF-7 au fost incubate timp de 72 de ore în prezența diferitelor concentrații de peptidă de soia, iar creșterea celulelor a fost evaluată prin testul MTT. Peptida de soia a inhibat creșterea celulelor MCF-7 într-o manieră dependentă de doză, cu aproape 50% suprimarea viabilității celulare la o concentrație de 500 μM (Figura 4A). Tratamentul peptidei de soia la 1 mM timp de 24 de ore a indus o fragmentare nucleară semnificativă, dovadă fiind colorarea nucleară DAPI, precum și modificările morfologice ale celulelor (Figura 4B). Inducerea apoptozei a fost confirmată în continuare prin dubla colorare a anexinei V-PI (Figura 4C). Am observat o creștere> de 7 ori a apoptozei în celulele tratate cu peptide de soia.

Suprimarea NF-κB și HSP90 de către peptida de soia induce apoptoza celulelor MCF-7 mamare umane. (A) Celulele MCF-7 au fost placate într-o placă cu 96 de godeuri la 5 x 103 celule și incubate la 37 ° C. După incubare peste noapte, celulele au fost crescute în mediu de control proaspăt sau în mediu proaspăt conținând concentrația indicată de soia peptidă timp de 72 de ore. Creșterea celulară a fost determinată prin absorbanță medie. Fiecare experiment a fost realizat în trei exemplare. (B) Peptida de soia induce fragmentarea nucleară. Celulele MCF-7 placate pe o lamă cu 4 camere au fost tratate cu peptidă de soia 1 mM timp de 24 de ore și apoi fixate în etanol, urmate de colorare DAPI. Morfologia celulară a fost observată prin microscopie cu lumină, iar nucleele au fost examinate prin microscopie cu fluorescență. (C) Inducerea morții celulelor apoptotice de către peptida de soia. Celulele MCF-7 tratate cu mediu sau 1 mM peptidă de soia timp de 24 de ore au fost incubate cu anexină V și PI marcate cu FITC și apoi analizate prin FACS. (D) Rezumat pentru suprimarea tumorigenezei mamare de către peptida de soia fără izoflavone.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Pentru a investiga în continuare mecanismul efectului chimiopreventiv și supresor al tumorii al peptidei de soia, am căutat moleculele sale țintă și am găsit HSP90 ca una dintre genele supra-reglementate. În plus, microarrayul nostru de ADNc a dezvăluit o supresie dramatică a kinazei 4 ciclin-dependente (cdk4) și a ARNm VEGF în țesuturile șobolanilor hrăniți cu o dietă peptidică din soia (Tabelul 3). În general, peptida de soia poate exercita un efect chimiopreventiv și supresor al tumorii prin inhibarea semnalizării mediate de NF-κB.

HSP90 este o chaperonă moleculară necesară pentru stabilitatea și funcția multor proteine ​​de semnalizare implicate în promovarea creșterii sau supraviețuirii celulelor canceroase sau a ambelor. Proteine ​​importante, cum ar fi Akt, Raf, Cdk4, Her2 și HIF-1α, au fost identificate drept clienți HSP, adesea implicați în căile de supraviețuire a celulelor canceroase suprapuse (Maloney și Workman, 2002; Neckers și Ivy 2003; Takayama și colab., Et al.)., 2003). Membrii HSP90 sunt, de asemenea, necesari pentru activitatea inductibilă și constitutivă a complexului IKK și a NF-κB (Broemer și colab., 2004). Analiza noastră de microarrays ADNc sugerează, de asemenea, implicarea potențială a peptidei de soia în alte procese importante, cum ar fi invazia tumorii și angiogeneza, controlul expresiei genei cheie și a activității. Împreună, peptida de soia poate inhiba multe procese biologice importante implicate în apoptoză, progresia ciclului celular, angiogeneza și invazia tumorală, rezultând efectul său chimiopreventiv și supresiv asupra tumorigenezei mamare in vivo. .

Pe scurt, una dintre principalele constatări ale acestui studiu a fost că peptida de soia fără izoflavone își poate exercita efectele chimiopreventive și supresive asupra tumorii prin inhibarea căii de semnalizare NF-κB implicată în multe aspecte ale tumorigenezei. Suprimarea factorului angiogenic major VEGF de către peptida de soia sugerează, de asemenea, potențialul său efect antiangiogenic mediat de suprimarea NF-κB în tumorigeneză mamară. Studiile care examinează efectele peptidei de soia asupra altor procese implicate în angiogeneză și metastază, precum și rezistența la medicamente, vor oferi o perspectivă suplimentară asupra mecanismului peptidei de soia epuizate cu izoflavonă în prevenirea și/sau suprimarea cancerului de sân, împreună cu efecte secundare minime. .

metode

Șobolani Sprague-Dawley de sex feminin au fost cumpărați de la Daehan Biolink Co., LTD (Chungbuk, Coreea). La vârsta de 3 săptămâni, șobolanii au fost hrăniți cu o dietă de creștere AIN-76 (Institutul American de Nutriție 76) timp de 1 săptămână. Animalele au fost adăpostite într-o cameră menținută la o temperatură constantă (22 ± 2 ° C) și umiditate (55 ± 5%) sub 12 ore de lumină și 12 ore de întuneric pe zi. La vârsta de 4 săptămâni, șobolanii au fost repartizați la unul din cele trei grupuri: 1) o dietă de control + un grup de ulei de susan (n = 12) au primit o dietă de control și au servit drept control negativ; 2) dieta de control + grupul DMBA (n = 12) a fost desemnat ca un control pozitiv și a primit o dietă de control; și 3) grupul peptidă de soia + grupul DMBA (n = 12) a primit o dietă experimentală conținând peptidă de soia (vezi infra). Dietele au fost furnizate sub formă de pulbere și apa de la robinet a fost furnizată, după cum este necesar, pentru toate cele trei grupuri.

Pregătirea dietei și prepararea peptidei de soia

Dieta AIN-76 a fost o dietă modificată a Institutului American de Nutriție 76 compusă din 18% proteine, 10% grăsimi, 15% amidon de porumb, 5% celuloză, 3,5% amestec mineral AIN-76, 1% amestec vitaminic AIN, 0,2, 2% bitartrat de colină și 47,3% zaharoză. Dieta de control a furnizat proteine ​​de cazeină și a fost izocalorică și izoproteică. S-a oferit și dieta peptidică din soia

Modelul tumorigenezei mamare

Analiza microcipului

ARN-ul total din tumorile mamare excizate a fost izolat utilizând extractant TRIzol (Gibco BRL, Rockville, MD) conform recomandărilor producătorului. Integritatea MRNA a fost confirmată prin denaturarea electroforezei cu gel de agaroză 1%. Microarrayul de ADNc de șobolan conținea clone de ADNc de 5K selectate din Indexul genei șobolanilor de la GenomicTree Inc. (Daejun, Coreea).

Analiza imunoblot și testul colorimetric al activității caspazei-3

Glandele mamare normale de șobolan și tumorile mamare (100 mg fiecare) au fost omogenizate în 800 μl de tampon de omogenizare rece cu gheață (20 mM HEPES [pH 7,4), 75 mM NaCl, 2,5 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA, 0,2 05% Triton X -100, 20 mM β-glicerofosfat, 1 mM Na 3 VO 4, 0,5 mM DTT, 10 mM NaF și cocktail inhibitor de protează (Roche, Mannheim, Germania) așa cum s-a descris anterior (Lee și colab., 2002) Lizați de țesut (50 μg ) au fost separate prin SDS-PAGE și imunoblotate cu anticorpii primari indicați împotriva NF-κB (p65, 1: 500), HSP90 (1: 1.000), p53 (1: 1.000), p21. (1: 500) și caspază- 3 (1: 1.000), urmată de incubare cu anticorpi secundari conjugați HRP corespunzători timp de 1 oră și apoi detectați cu reactiv ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL), așa cum a fost descris anterior (Park și colab., 2005) aceeași cantitate de proteine ​​a fost confirmată prin incubare cu anticorp anti-β-actină. Pentru a determina activitatea caspazei-3, 40 μg din fiecare lizat tisular a fost incubat cu colorimetru i c Substratul DEVD (Calbiochem) la 30 ° C timp de 3 ore și apoi absorbanța la 405 nm (OD 405) a fost măsurată folosind un cititor de spectrometrie Xfluor 4 (TECAN, Austria).

imunohistochimie

Colorarea cu imunoperoxidază a fost efectuată conform protocoalelor furnizate de producător (kit Dako LSAB; Dako, Carpinteria, CA), așa cum s-a descris anterior (Nam și colab., 2001). Pe scurt, secțiuni groase de 5 μm montate pe lamele au fost tratate cu anticorpii primari indicați (anti-NF-κB [p65], 1: 500; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) sau anticorp anti-HSP90 (1).: 1.000; Stressgen Biotechnologies, Victoria, Canada), urmată de incubație cu anticorpi secundari biotinilați. Peroxidaza legată a fost vizualizată prin adăugarea de soluție substrat-DAB și lamelele au fost contracolorate cu hematoxilină Mayer (DAKO) pentru colorarea nucleelor. Celulele colorate pozitiv păreau maronii, în timp ce celulele negative păreau albastre.

Cultura celulară și testul MTT

Celulele MCF-7 derivate din adenocarcinomul mamar uman au fost obținute din colecția American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Celulele au fost crescute în RPMI 1640 suplimentat cu 10% FBS și 1% penicilină și streptomicină într-o atmosferă de 5% CO 2 la 37 ° C. Testul colorimetric MTT a fost efectuat așa cum este descris mai sus (Park și colab., 2001). Inhibarea creșterii a fost măsurată prin absorbanță medie utilizând un cititor de plăci (Termomax, dispozitiv molecular) la 540 nm. Fiecare experiment a fost realizat în trei exemplare.

Testele de apoptoză

Moartea celulară mediată de apoptoză a fost examinată așa cum este descris (Lee și colab., 2008) cu modificări minore. Pe scurt, celulele MCF-7 au fost însămânțate pe lamele de cameră la o densitate de 5 x 104 celule per godeu și apoi tratate cu peptidă de soia 1 mM dizolvată în mediu RPMI 1640 timp de 24 de ore. Celulele au fost incubate cu anexină V și iodură de propidiu (PI) marcată cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) timp de 15 minute și apoi analizate pe un avantaj FACS (Becton Dickinson, San Jose, CA). Pentru a evalua morfologia nucleară, celulele au fost plasate pe o lamă, fixate în metanol și colorate cu DAPI (1 μg/ml în metanol) timp de 15 minute, spălate de trei ori cu 1 x PBS și apoi tratate cu VectaShield (Vector Laboratories) ( Burlingame, SUA). CA) și examinat la microscopul de fluorescență.

analize statistice

Greutatea corporală și aportul de alimente au fost determinate și semnificația statistică a diferențelor în date a fost evaluată de ANOVA unidirecțional. Greutatea tumorii, latența, volumul tumorii și multiplicitatea tumorii au fost calculate printr-un test t independent la fiecare moment. Valoarea probabilității COX-2 a fost considerată semnificativă statistic