abstract

Această lucrare prezintă dovezi directe că gena bcl-2 este reglementată transcripțional de factorul nuclear -B (NF-κB) și leagă direct calea de semnalizare TNF-α/NF-κB de expresia Bcl-2 și răspunsul său la supraviețuirea umană. celulele canceroase de prostată. Urmele DNasei I, întârzierea gelului și analiza supershift au identificat un site NF-κB în promotorul bcl-2 β2. În contextul promotorului minim, acest site bcl-2 p2 1 a crescut transcrierea de 10 ori în prezența vectorilor de expresie p50/p65, comparabilă cu creșterea observată la site-ul consens NF-κB, în timp ce pentru promotorul p2 complet Transcripțional activitatea regiunii în regiune a crescut de 6 ori excesiv.expresia NF-κB, efect eliminat prin mutarea sitului bcl-2 p2 1. Expresia Bcl-2 a fost asociată cu un fenotip rezistent la hormoni al cancerului de prostată avansat. Aici, am arătat că creșterea nivelului de expresie Bcl-2 în linia celulară de cancer de prostată umană LNCaP observată ca răspuns la retragerea hormonilor este îmbunătățită în continuare prin tratamentul TNF-α, iar acest efect este atenuat de inhibitorii NF-κB. În același timp, studiile promotorilor bcl-2 β2 în celulele LNCaP arată o creștere de 40 de ori a activității promotorului după stimularea cu TNF-α în absența hormonului.

În ultimii ani, au existat dovezi în creștere că căile de semnalizare a apoptozei sunt implicate în multe stări de boală, inclusiv în cancer. Un jucător cheie în apoptoză este familia de proteine ​​Bcl-2, care poate fi împărțită fie în anti-apoptoză (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, A1 și Mcl-1), fie pro-apoptoză (Bax, Bid, Bad, Bak, Bic, Bok, Bcl-XS și Hrk) membri (revizuiți în Gross și colab., 1999). Multe studii sugerează că nivelurile relative ale acestor proteine ​​proapoptotice și antiapoptotice dintr-o celulă determină dacă celula trăiește sau moare ca răspuns la semnalizarea apoptotică (Oltvai și colab., 1993; Oltvai și Korsmeyer, 1994). Modul exact în care Bcl-2 oferă protecție împotriva apoptozei este încă neclar; cu toate acestea, se crede că previne direct sau indirect eliberarea citocromului c din mitocondrii, ceea ce la rândul său previne activarea Apaf-1 și a caspazelor din aval (Zou și colab., 1997).

Tabel în dimensiune completă

Studii recente au legat expresia Bcl-2 de dezvoltarea unui fenotip rezistent la hormoni al cancerului de prostată avansat (Colombel și colab., 1993; McDonnell și colab., 1992; Raffo și colab., 1995). Acum, de asemenea, se pare că expresia Bcl-2 poate proteja celulele canceroase de prostată de mulți stimuli apoptotici diferiți, cum ar fi ablația hormonală, radioterapia și chimioterapia, inclusiv tratamentul TNFα (Apakama și colab., 1996; Chaudhary și colab., 1999; Huang și colab. și colab., 1998; Mackey și colab., 1998). Studiile care examinează relația dintre Bcl-2 și NF-κB în reglarea apoptozei induse de TNF-α în celulele canceroase de prostată au descoperit că inhibarea exportului nuclear NF-κB de către celulele sensibile la mutant I dominantB dominant-negative la induse de TNF-α apoptoza și supraexpresia exogenă de Bcl-β 2 au blocat efectiv acest efect (Herrmann și colab., 1997). În acest studiu, investigăm reglarea transcripțională a bcl-2 de către NF-κB și semnificația acesteia pentru expresia endogenă a Bcl-2 în celulele canceroase de prostată umană după expunerea la TNF-α.

Rezultatul

Identificarea situsului (factorilor) de legare a factorului de transcripție NF-κB în promotorul bcl-2 p2 utilizând NF-κB1 recombinant

Localizarea sitului (siturilor) de legare a factorului de transcripție NF-κB în regiunile promotorului bcl-2 a fost identificată prin analiza amprentei DNase I utilizând proteina p50 recombinantă purificată (NF-κB1) (Figura 1). Protecția a fost observată în mod clar într-o regiune (locul 1) a promotorului bcl-2 p2 (Figura 1, banda 2) și în concordanță cu această observație, s-a constatat că secvența acestei regiuni conține un element cu 80% identitate cu NF- sequenceB secvență consens (Tabelul 1).). De asemenea, a fost identificat un al doilea site mai puțin convingător (site-ul a), dar în această regiune s-a găsit doar un acord slab cu secvența de consens (Tabelul 1, denumit site-ul 2). Nu s-au observat urme în regiunea promotorului bcl-2 p1 (datele nu sunt prezentate).

transcripțională

Analiza DNase I a promotorului bcl-2 p2 cu proteină recombinantă NF-κB. Fragmentul de ADN p2 marcat la capătul 5 'a fost incubat în absență (banda 1) sau în prezența p50 recombinant (banda 2) înainte de digestia DNazei. Secvența ADN fără legătură (markeri) este adiacentă la banda 1 și a fost utilizată pentru localizarea siturilor 1 și a site-ului NF-κB. picioare. Săgețile indică locația regiunilor protejate. Autoradiografia arată un experiment reprezentativ

Imagine la dimensiune completă

Întârzierea gelului și analiza complexă super-schimbare a regiunilor reglatoare ale promotorului bcl-2 p2 cu proteină NF-κB1 recombinantă. Au fost analizate 33 sonde oligonucleotidice dublu catenare marcate cu bcl-2 p2 site-ul 1 (benzile 4 și 5), site-ul 2 (benzile 6 și 7) și consensul NF-κB (benzile 1, 2, 3, 8 și 9). pentru capacitatea lor de a forma retardarea gelului și complexe de supershift cu p50 recombinant. Anticorpul anti-p50 de iepure (Calbiochem-Novabiochem Corp.) a fost incubat cu extractul analizat după cum s-a indicat. Secvența consens NF-κB nemarcată a oligonucleotidei cu catenă dublă a fost utilizată ca concurent în banda 1 și în benzile 8 și 9, s-a adăugat un factor nuclear competitiv nelegat fără etichetă al concurenței hepatocitelor (HNF-3) pentru a demonstra specificitatea complexul observat. Un consens de secvență dublu-catenar desemnat ca element de răspuns cAMP (CRE) a fost, de asemenea, utilizat pentru a testa specificitatea interacțiunii. Autoradiografia arată un experiment reprezentativ

Imagine la dimensiune completă

Caracterizarea proteinelor de legare a ADN-ului în extracte de celule nucleare din celule LNCaP tratate cu TNF-α sau celule WEHI 231 care interacționează cu site-ul de legare presupus bF1-2 p2 al promotorului NF-κB.

Imagine la dimensiune completă

Nu s-au observat complexe superschimbate cu anticorp anti-sp1 irelevant (datele nu sunt prezentate). Astfel, această analiză supershift cu anticorpi anti-p65 și anti-p50 oferă dovezi fizice suplimentare că bcl-2 p2 site-ul 1 leagă de fapt complexele NF-κB.

Transactivarea transcripției NF-κB din promotorul bcl-2 p2 este mediată de site-ul bcl-2 p2 1

Analiza funcțională a site-urilor putative bcl-2 p2 ale promotorului NF-kB în contextul promotorului minim. Constructele examinate conțin o secvență consens NF-κB (KB), bcl-2 p2 site 1 (site 1) și bcl-2 p2 site2 (site 2) oligonucleotide dublu catenare clonate în constructorul promotor minim pTATA (vezi schema). deasupra). Numărul copiei oligonucleotidei din construct este indicat între paranteze în numele constructelor. Activitățile relative ale constructelor din celulele Hela S3 au fost examinate în prezența (+) și absența (-) p50/p65 (NF-κB) exprimate exogen folosind vectorii de expresie pCMVp50 și pCMVp65. Activitățile transcripționale sunt raportate în comparație cu constructul pNF-κB (2) în prezența NF-κB, care este desemnat receptor cu o activitate relativă de 1,0. PRL-TK a fost utilizat pentru a corecta eficiența transfecției. Aceste rezultate reprezintă media a trei experimente separate, iar barele de eroare indică abaterea standard

Imagine la dimensiune completă

Transactivarea transcripției din promotorul bcl-2 p2 de către NF-κB și abolirea acestui efect prin mutageneza direcționată către site a sitului putativ 1. Construcțiile p2LUC conțin o secvență promotor bcl-2 p2 de la -754 la +1 localizat direct 5 'Fără gena promotorului de luciferază (LUC) fără promotor în pbasic (Promega) astfel încât promotorul bcl-2 p2 direcționează expresia genei LUC. Plasmidele p2M1LUC și p2M2LUC care conțin site-uri mutante 1 sau 2 au fost generate din p2LUC utilizând trusa de mutageneză direcționată către site-ul GeneEditor (Promega). Activitatea relativă a constructelor în celulele Hela S3 a fost examinată în prezența (+) și absența (-) de p50/p65 exprimate exogen folosind vectorii de expresie pCMVp50 și pCMVp65. Activitățile transcripționale sunt comparate cu constructul p2LUC în absența NF-κB, care este indicat a avea o activitate relativă de 1.0.PRL-TK a fost utilizat pentru a corecta eficiența transfecției. Aceste rezultate reprezintă media a patru experimente separate, iar barele de eroare indică abaterea standard

Imagine la dimensiune completă

Tratamentul TNF-α și expresia Bcl-2 în celulele LNCaP ale cancerului de prostată uman

Creșterea expresiei Bcl-2 ca răspuns la absorbția hormonilor este crescută în continuare în prezența TNF-α. Celulele carcinomului de prostată uman LNCaP au fost cultivate în mediu care conține 10% ser epuizat de cărbune activ în prezența (+ H) sau absența (-H) a hormonului (0,5 nM 6α-fluorotestosteron) peste noapte înainte de adăugarea de NF-κB și/sau inhibitori ai TNF-β. Inhibitorii (Bay 11-7082 [10 μM] și peptida inhibitoare NF-κB permeabilă la celule [100 mg/ml]) sau peptida martor NF-κB permeabilă la celule [100 mg/ml] au fost incubate cu celule timp de 15 zile. min. la 37 ° C înainte de a adăuga TNF-α (10 ng/ml). Incubarea la 37 ° C a fost apoi continuată timp de încă 6 ore înainte de liza celulară și analiza proteinelor (100 μg) prin imunoblotare împotriva Bcl-2. Aceeași sarcină a fost confirmată de soluția Ponceau S (Sigma Chemical Co) prin colorare

Imagine la dimensiune completă

Transactivarea transcripției din promotorul bcl-2 p2 în celulele LNCaP ca răspuns la retragerea hormonilor și stimularea TNF-α

Pentru a investiga efectul retragerii hormonilor și a stimulării TNF-α asupra activității promotorului bcl-2 p2 în celulele LNCaP, s-au efectuat experimente de transfecție tranzitorie folosind constructorul promotorului p2 (p2LUC), care conține promotorul bcl-2 p2 de lungime completă în amonte de gena luciferazei mucoasei. Figura 7A). Activitățile transcripționale sunt comparate cu constructul p2LUC în absența TNF-α (-TNF-α) și a prezenței unui hormon (+ hormon), care este desemnat ca un receptor cu o activitate relativă de 1,0.

Imagine la dimensiune completă

S-a constatat că absorbția hormonală crește de 8 ori activitatea transcripțională a promotorului p2, iar tratamentul TNF-α în absența hormonului mărește dramatic activitatea promotorului, de 40 de ori peste p2LUC în absența TNF-α și în prezența hormonul. (Vectorul de control pbasic a prezentat activitate neglijabilă în toate condițiile). Aceste rezultate confirmă rezultatele obținute pentru expresia proteinei Bcl-2 în celulele LNCaP. Pentru a demonstra în continuare că transactivarea transcripției din promotorul bcl-2 p2 în celulele LNCaP ca răspuns la absorbția hormonului și stimularea TNF-α este mediată de NF-κB, activitatea transcripțională a promotorului bcl-2 p2 a fost evaluată în aceste condiții . și după co-transfecția celulelor LNCaP cu constructul negativ dominant pCMV IκB (Upstate Biotechnology). Acest vector exprimă IκB non-fosforilabil, nedegradabil (Figura 7B). Rezultatele raportate aici arată că transactivarea promotorului bcl-2 β2 în celulele LNCaP activate de TNF-α este inhibată de ablația semnalizării NF-κB. Luate împreună, aceste date sugerează un rol predominant pentru calea TNF-α/NF-κB în reglarea transcripțională a bcl-2 în celulele canceroase de prostată prin intermediul promotorului p2.

$ config [ads_text16] nu a fost găsit

discuţie

Materiale și metode

Cultură celulară, transfecții și teste de luciferază

Linia de celule B imatură, WEHI 231, și linia de celule de carcinom cervical uman, Hela S3 (ATCC), au fost menținute în mediul Eagle modificat (DMEM) al lui Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal de vițel și 0,45% glucoză (Gibco Laboratories). la 37 ° C în 5% CO2/aer. Celulele WEHI 231 au fost suplimentate cu β-mercaptoetanol 50 μM așa cum s-a descris în altă parte (McCormack și colab., 1984). Înainte de tratament, celulele WEHI 231 au fost diluate la o densitate de 3,5 x 105 celule/ml cu mediu proaspăt și incubate timp de 5 ore. Linia celulară de carcinom de prostată umană LNCaP-FGC (ATCC), menționată în acest raport ca LNCaP, a fost cultivată în RPMI-1640 suplimentată cu 10% ser fetal bovin sau ser fetal bovin fetal fără cărbune (Bioproduse Gemeni), care conținea 10 % ser fetal bovin. 50 unități/ml penicilină și 50 ug/ml streptomicină.

Transfecțiile au fost efectuate în plăci cu 6 godeuri așa cum s-a descris mai sus (Graham și van der Eb, 1973; Sorge și colab., 1984). Amestecul de ADN transfectat conținea 5 μg de plasmidă LUC de mușchi (vezi secțiunea de clonare și mutageneză de mai jos) și 250 ng de pRL-Tk (Promega), care a servit drept control intern pentru eficiența transfecției. pRL-TK controlează expresia genei reniluciferazei (RL) utilizând promotorul timidin kinazei al virusului herpes simplex. După caz, amestecul de ADN conținea, de asemenea, 100-250 ng de vectori de expresie NF-κB (pCMV-p50 și pCMV-p65), vectorul de control pCMV-PA (un dar generos de la LR Faust) sau ADNc pUSE-IκB dominant negativ (S32A/S36A) (Upstate Biotechnology). Extractele celulare au fost preparate 48 de ore după transfecție și testate pentru activitatea de salcâm și luciferază renilă folosind kitul stop și glo (Promega) conform instrucțiunilor producătorului.

Clonarea și mutageneza

Extracte din nuclee și celule întregi

Extractele nucleare au fost preparate din LNCaP sau WEHI 231 în esență așa cum s-a descris (Prösch și colab., 2000). Celulele au fost tratate cu TNF-a (50 ng/ml) (Sigma) timp de 2 ore la 37 ° C peste noapte înainte de prepararea extractelor. Extractele de celule LNCaP au fost preparate în esență așa cum este descris în altă parte (Miyake și colab., 1998). Pentru analiza expresiei Bcl-2, celulele au fost incubate în mediu conținând 10% ser epuizat de cărbune activ în prezența sau absența hormonului (0,5 nM 6α-fluorotestosteron) peste noapte înainte de adăugarea inhibitorilor NF-κB și/sau TNF-α. Inhibitorii (peptida inhibitoare Bay 11-7082 sau NF-κB) sau peptida martor (toate din Biomol) au fost incubate cu celule timp de 15 minute la 37 ° C înainte de adăugarea de TNF-a (10 ng/ml). Incubarea la 37 ° C a fost apoi continuată timp de încă 6 ore, apoi celulele au fost lizate și analizate prin imunoblotare.

Analiza imunoblotului

Expresia Bcl-2 a fost examinată în esență așa cum a fost efectuată în altă parte (Miyake și colab., 1998). Probele care conțin 100 μg de proteine ​​au fost supuse SDS-PAGE și transferate la o membrană de nitroceluloză. Filtrele au fost blocate în PBS conținând lapte praf degresat 5% la temperatura camerei timp de 1 oră și apoi incubate timp de 3 ore la temperatura camerei cu o diluție 1: 100 a anticorpului monoclonal anti-bcl-2 de șoarece (Santa Cruz, CA, SUA). Membranele au fost apoi incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu anticorp IgG anti-șoarece conjugat cu fosfatază alcalină (Caltag) și proteinele specifice au fost vizualizate printr-un sistem colorimetric (BCIP/NBT) conform instrucțiunilor producătorului (Biorad). Aceeași sarcină a fost confirmată de colorarea Ponceau S (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA).

Amprenta DNase I, test de schimbare a gelului de electromobilitate și teste de supershift

Reacțiile de amprentă cu DNază I au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (Briggs și colab., 1986; Johnson și colab., 1995). Reacțiile au conținut 1-5 ng de fragment de ADN marcat la capăt în 100 μl dintr-un amestec de reacție conținând 10 mM Tris-clorhidrat (pH 7,9), 50 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 1 m M DTT, 0,5 m M PMSF., 10 % (v/v) glicerol, 1 μg poli [d (IC)] și p50 purificat (Promega). Legarea a fost efectuată timp de 15 minute la 0 ° C, urmată de 2 minute și apoi oprită prin adăugarea a 100 μl de 1% (greutate/volum) NaDodSO 4, 20 mM EDTA, 200 mM NaCl conținând 250 μg/ml. ARNt. Amestecul a fost apoi extras cu fenol, etanol precipitat și analizat prin electroforeză pe gel de uree-acrilamidă 6% și autoradiografie.

Mulțumiri

Această lucrare a fost parțial susținută de grantul USPHS AI-44434, Stein Endowment Fund și Skaggs Education Grant. Dorim să mulțumim Julia M Ruedia pentru asistență tehnică și Carol Fedoryszyn pentru că a ajutat la pregătirea acestui manuscris. PC Atterton a furnizat servicii de scriere tehnică.