obiecte

abstract

La femei, celulele germinale sunt menținute în structuri ovariene numite foliculi primordiali. Numărul de foliculi primordiali din rezerva ovariană este un factor determinant al fertilității. În ciuda acestei importanțe, există o lipsă de cunoaștere a mecanismelor fiziologice exacte care reglează numărul foliculilor preistorici. În acest studiu, arătăm că un val de epuizare a foliculilor primari apare la șoareci în timpul tranziției la maturitate. Am arătat că această pierdere bruscă și dramatică a foliculilor primordiali este declanșată hormonal și identifică doar proteina pro-apoptotică BH3, un factor modificator BCL-2 (BMF) care este esențial pentru acest proces, implicând o cale apoptotică intrinsecă ca mecanism cheie . Eliminarea foliculilor primordiali în timpul pubertății nu este doar un eveniment de dezvoltare remarcabil, ci este, de asemenea, important din punct de vedere fiziologic, deoarece reduce în cele din urmă disponibilitatea foliculilor primordiali și determină durata fertilității. Luate împreună, aceste descoperiri indică faptul că pubertatea este o fereastră de dezvoltare critică pentru reglarea dimensiunii rezervei ovariene, care afectează fertilitatea feminină și longevitatea reproducerii.

Principalul

Rezerva ovariană de foliculi primordiali care nu cresc, reprezintă întreaga cantitate de ovocite disponibile femeilor pentru a susține fertilitatea în timpul vieții reproductive. Majoritatea foliculilor primordiali există într-o stare inactivă, dar mai mulți sunt activați pentru a începe procesul foliculogenezei. Foliculogeneza se termină în cele din urmă cu atrezie foliculară sau mai rar culminează cu ovulația unui ovocit matur. Intrarea continuă a foliculilor primordiali într-un bazin în creștere de foliculi duce la epuizarea treptată a rezervei ovariene pe măsură ce femeile îmbătrânesc, infertilitatea apare atunci când numărul foliculilor scade sub un prag critic. Aprovizionarea foliculilor primordiali poate fi epuizată prematur de agenți care induc stres genotoxic (de exemplu, multe medicamente anticanceroase și radiații), ducând la apoptoza ovocitelor și la atrezia foliculară. 3, 4 Cu toate acestea, măsura în care apoptoza reglată în dezvoltare, spre deosebire de apoptoza indusă ca urmare a expunerii la stimuli exogeni specifici, contribuie direct la declinul normal postnatal al foliculilor primordiali este mai puțin clară și factorii care influențează momentul infertilității asociate cu maternitatea îmbătrânirea rămâne slab caracterizată.

Numeroase studii au documentat o scădere numerică a foliculilor primordiali după naștere. 1, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Un astfel de studiu la șoareci a arătat că rezerva ovariană inițială a foliculilor primordiali este epuizată cu mai mult de două treimi între ziua postnatală (PN) 6 și 45. 8 După PN45, când șoarecii sunt considerați maturi sexual, foliculii primordiali au dispărut din rezerva ovariană mult treptat. Pe baza acestor date și presupunând o rată constantă de pierdere, studiile de modelare matematică au estimat că aproximativ 80 de foliculi primordiali sunt activați în fiecare zi pentru a deveni foliculi primari și

150 de foliculi primordiali suferă atrezie în fiecare zi în ovarul juvenil. Astfel, există dovezi care sugerează că apoptoza care duce la atrofie foliculară poate contribui semnificativ la reducerea dimensiunii rezervei ovariene după naștere, cel puțin la șoareci foarte tineri. Cu toate acestea, nu a fost explorat conceptul că un număr mare de foliculi poate fi pierdut în timpul unor evenimente de dezvoltare importante postpartum. În special, numărul foliculilor primordiali și dinamica în timpul pubertății la șoareci nu au fost studiate și mecanismele moleculare care stau la baza pierderii foliculului primordial postnatal au rămas volatile.

Rezultatul

Rezerva ovariană a foliculilor primordiali este epuizată într-un proces dependent de BMF la șoareci între PN40 și PN50.

Foliculii au fost numărați în ovarele șoarecilor WT și Bmf -/- la PN20, 30, 40 și 50, care depășește perioada de timp în care șoarecii femele trec de la adolescenți la adulți maturi sexual (figurile 1a la f). Această perioadă de tranziție se numește pubertate. Numărul de foliculi primordiali a fost similar în ovarele șoarecilor WT și Bmf -/- la PN20, 30 și 40 și a rămas relativ constant în acest timp (Figurile 1a și e, Tabelele suplimentare 1 și 2). În mod remarcabil, numărul foliculilor primordiali a scăzut semnificativ între PN40 și PN50 în ovarele femeilor cu WT (Figura 1a), dar a rămas crescut în ovarele femelelor Bmf -/-, indicând un rol crucial pentru BMF în această epuizare (Figura 1a, Tabelele 1 și 2 din anexă). Scăderea numărului de foliculi primordiali în ovarele WT între PN40 și PN50 nu a fost asociată cu o creștere concomitentă a numărului de foliculi primari, secundari sau anali, adică foliculi în creștere (Figurile 1a - c) și a existat o pierderea numărului de foliculi (Figura 1d). Aceste date sugerează că epuizarea rezervei ovariene nu s-a datorat unei rate crescute de activare a foliculului primordial și de tranziție la un grup de foliculi în creștere. În schimb, aceste observații sunt în concordanță cu ipoteza că aproximativ 50% din rezerva ovariană (

1800 de foliculi primordiali) se pierd direct în această perioadă de 10 zile de atrofia dependentă de BMF. Pierderea dramatică a foliculilor primordiali pare limitată la această perioadă de tranziție relativ scurtă, deoarece studiile noastre anterioare arată că epuizarea rezervei primordiale este mult mai graduală la șoarecii adulți în restul vieții reproductive. În mod interesant, în PN50 în ovarele femelelor Bmf -/- au fost prezenți semnificativ mai mulți foliculi secundari și antrali decât șoarecii WT (Figurile 1c și f), indicând probabil o supraviețuire crescută la această populație de foliculi. Această din urmă observație este în concordanță cu rolul critic al BMF în atrezia foliculului secundar și antral, pe care l-am descris anterior. 5

este

Imagine la dimensiune completă

Atrezia foliculară la șoareci femele WT și Bmf -/- adolescenți și adulți

Atrezia foliculară ovariană la șoareci WT și Bmf -/-. Numărul de foliculi atretici a fost determinat în ovarele șoarecilor WT și Bmf -/- la PN20, 30 40 și 50 (n = 6/vârstă/genotip). ( A ) Imagini reprezentative ale foliculilor preantrali (secundari) și antrali atretici în secțiuni ovariene colorate cu PAS de la șoareci WT și Bmf -/- la PN50. Foliculii preantrali și antrali atretici s-au caracterizat prin prezența ovocitelor degradante și/sau a celulelor granuloase piknotice. Scara = 50 μm. ( b ) Imagini reprezentative ale foliculilor atretici pozitivi TUNEL (colorare maro) în foliculii secundari din secțiuni ovariene de la șoareci WT și Bmf -/- la PN50. Scara = 50 μm. ( c ) Datele sunt exprimate ca medie ± SEM # de P -/- față de femele WT la fiecare vârstă de P -/- femele la fiecare vârstă. Vezi tabelele suplimentare 1 și 2 pentru semnificația statistică a tuturor comparațiilor perechi dintr-un genotip

Imagine la dimensiune completă

Tranziție pubertară la șoareci WT și Bmf -/-

Debutul pubertății la șoareci WT și Bmf -/-. ( A ) Procentul de șoareci WT și Bmf -/- cu cel puțin un corp galben prezent în ovarele lor a fost determinat la PN20, 30, 40 și 50 (n = 6/vârstă/genotip). Numărul șoarecilor analizați este prezentat deasupra fiecărei coloane. ( b ) Numărul mediu de corpuri lutea prezente pe ovar la șoareci WT și Bmf -/- (doar șoarecii cu cel puțin un corp lutea au fost incluși în analiză) au fost determinați în PN20, 30, 40 și 50. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM (unde n = 3 sau mai mult). # P -/- comparativ cu WT la PN50 (test de t student nepereche în două puncte). ( c ) Imagini reprezentative ale secțiunilor ovariene colorate cu PAS de la șoareci WT și Bmf -/- la PN20, 30, 40 și 50. Denumirea „CL” indică locația fiecărui corp luteu. Scara = 200 μm

Imagine la dimensiune completă

Pierderea foliculului în timpul pubertății este declanșată mai degrabă hormonal decât în ​​funcție de vârstă

Deși nu este clar de ce un număr atât de mare de foliculi sunt eliminați în acest moment al maturizării sexuale, două studii recente la șoareci pot oferi o oarecare perspectivă. 33, 34 Aceste studii sugerează că există două populații de foliculi primordiali în ovare care au roluri funcționale diferite. 33, 34 Foliculii primari, care se formează în principal în fundația foliculară în ovarul fetal, se caracterizează prin poziția lor în măduvă și activarea rapidă la naștere. Majoritatea acestor foliculi se pierd/se utilizează înainte de PN60 și contribuie în primul rând la formarea maturității sexuale funcționale și a ciclicității endocrine. Cohorta de foliculi primordiali secretată din ovare în timpul pubertății pe care am caracterizat-o în acest studiu poate aparține acestei prime populații. A doua populație de foliculi primordiali se formează puțin mai târziu în ovarul fătului, este localizată în cortexul ovarian și este responsabilă în primul rând de fertilitatea adultului. 33, 34 Luate împreună, aceste date sugerează că există diferențe funcționale în foliculii primordiali înainte și după pubertate și că procesele de maturare în timpul adolescenței, inclusiv pierderea foliculilor anormali și capacitatea crescută de a dezvolta foliculi, pot fi importante pentru formarea completă a foliculilor. ovar adult.

Deși numărul foliculilor legați de pubertate nu a fost studiat în mod specific la fete înainte și după pubertate (și poate să nu fie posibil din cauza disponibilității limitate a probelor de țesut adecvat), datele bazate pe vârstă sugerează că numărul foliculilor primordiali scade cu aproximativ unu. jumătate în perioada adolescentului/adultului tânăr la om (cu vârsta cuprinsă între 13-25 ani), 1 similar cu ceea ce am observat în modelul nostru de șoarece. Recent, s-a constatat că populațiile de foliculi primordiali suferă modificări morfologice și funcționale odată cu vârsta și pubertatea la om: 35 aproape 20% din foliculii primordiali din ovarele umane pre-pubertare au fost anormale (definite ca foliculi cu un ovocit neobișnuit de mare, cu o colorare slabă). nucleu) .care foliculi anormali primordiali nu au fost observați niciodată în țesuturile adulte. Autorii au speculat că foliculii primordiali de calitate scăzută au fost eliminați sau utilizați preferențial înainte de introducerea ovulației la vârsta adultă. Aceste date sugerează că modificările ovarelor în timpul pubertății depășesc recrutarea ciclică a foliculilor antrali pentru ovulație și includ modificări ale dimensiunii rezervei ovariene a foliculilor primordiali.

Pe scurt, am constatat că aproximativ 50% din foliculii primordiali se pierd direct din rezerva ovariană imediat înainte de maturitate într-un proces care necesită proteina proapoptotică BMF și este declanșat de gonadotropină. Am publicat pubertatea ca un moment important de dezvoltare în timpul căruia rezerva ovariană este semnificativ epuizată și, important, am arătat deja că această reducere a numărului de foliculi reduce în cele din urmă viața fertilă a unei femei. Munca noastră aruncă o nouă lumină asupra mecanismelor de dezvoltare care reglează mărimea rezervelor ovariene și determină numărul de foliculi disponibili pentru a susține fertilitatea feminină. În plus, aceste date oferă o nouă înțelegere a modului în care rezerva ovariană este reglementată în timp, arătând că, în loc de pierderea stabilă a foliculilor primordiali postnatal, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 36 este un val de pierdere a foliculului activ. este declanșat la pubertate și are ca rezultat epuizarea rapidă a bazinului folicular.

Materiale și metode

Șoarecii Bmf -/- pe un fundal C57BL/6 au fost descriși mai sus. 13 șoareci C57BL/6 (WT) și Bmf -/- au fost adăpostiți într-un dispozitiv de barieră controlată la temperatură ridicată (Monash University ARL) cu acces gratuit la șoareci și apă și un ciclu lumină-întuneric de 12 ore. Toate procedurile și experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu codul australian de îngrijire și utilizare a animalelor NHMRC și aprobate de Comitetul de etică a animalelor Monash.

Evaluarea numărului de foliculi sănătoși

Stereologia obiectivă a fost utilizată pentru a determina numărul de foliculi. Stereologia este recunoscută ca o metodă de bună practică pentru cuantificarea celulelor în secțiuni de țesut. 37 de ovare de la șoareci WT și Bmf -/- (PN20, 30, 40, 50, n = 6/vârstă/genotip) au fost fixate în soluția Bouin, tratate cu rășină hidroxietil metacrilat (Technovit 7100; Kulzer and Co., Friedrichsdorf, Germania ) și apoi distribuite în serie la 20 μm cu un microtom Leica RM2165 (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Germania). Secțiunile au fost colorate cu acid periodat-Schiff și hematoxilină. Metodologia pentru numerele de foliculi stereologi a fost descrisă în detaliu. 6, 38 Pe scurt, pe un microscop Olympus BX50 (Tokyo, Japonia), am folosit un obiectiv de imersie cu ulei de 100 × cu fază de scanare automată (Autoscan Systems Pty Ltd, Melbourne, VIC, Australia), care a fost controlat de sistemul stereologic StereoInvestigator ( versiunea 11.06.02, MBF Bioscience 2015, MicroBrightField, Inc., Williston, VT, SUA). Fiecare a treia porție a fost numărată și numărul de foliculi a fost determinat prin înmulțirea numărului de ovocite brute luate (Q -) cu toate cele trei fracții de eșantionare (1/f1, 1/f2 și 1/f3). 38

Evaluarea numărului de foliculi atretici

Numărul de foliculi atretici a fost numărat în secțiuni consecutive de 20 μm de glicometacrilat de-a lungul ovarului utilizând metoda de fracționare/disecție fizică, așa cum este descris mai sus. Foliculii primordiali, primari și secundari au fost clasificați ca atretici dacă conțineau un ovocit degenerat (indicat de o membrană plasmatică accelerată neregulat sau de o veziculă fragmentată a liniei germinale) sau dacă celulele granuloase erau fragmentate sau aveau nuclei fuzionați pirotici. Foliculii antrali au fost considerați atretici dacă mai mult de 10% din celulele lor granuloase erau apoptotice sau dacă conțineau un ovocit degenerat.

Evaluarea pubertății: numere corpora lutea

Numărul de corpuri lutea a fost determinat prin numărarea directă a fiecărei șase secțiuni consecutive de 20 μm glicometacrilat care conțin întregul ovar. Secțiunile adiacente au fost evaluate pentru a se asigura că fiecare corp lutea a fost numărat o singură dată.

Suprimarea pubertății

Antagonistul hormonal de eliberare a gonadotropinei Cetrorelix (Sigma, Castle Hill, NSW, Australia, nr. 5249) a fost utilizat pentru a întârzia pubertatea la șoareci WT folosind dozele zilnice așa cum este descris mai sus la rozătoare. 39, 40, 41 Injecții (0,1 ml) de soluție salină sau Cetrorelix (0,5 mg/kg greutate corporală/zi) au fost administrate subcutanat zilnic timp de 25 de zile (n = 6 șoareci/grup). Tratamentul a fost început înainte de apariția pubertății, care la șoarecii femele se manifestă mai întâi ca o deschidere vaginală, care apare la aproximativ PN28 +/− 2 în colonia noastră de șoareci. Prin urmare, tratamentul a fost început la PN25 și a continuat până la sfârșitul experimentului la PN50. Toate animalele au fost monitorizate zilnic prin inspecție vizuală pentru deschiderea vaginală. Odată ce a fost observată deschiderea vaginală, tampoanele vaginale au fost colectate zilnic pentru a monitoriza esterii.

Stimularea cu gonadotropină corionică ecvină și gonadotropină corionică umană

Șoarecii WT femele imaturi sexual PN20 au fost injectați cu soluție salină (martori) sau gonadotropină corionică ecvină (eCG, 5IU), urmată de 44-48 de ore mai târziu prin injecție cu gonadotropină corionică umană (hCG, 5IU) (n = 6/grup). În PN30, ovarele au fost colectate și foliculii primordiali au fost numărați.

Colorare TUNEL

Pentru a detecta celulele apoptotice în secțiuni ovariene, a fost utilizat un set de detectare a apoptozei pentru a detecta apoptoza într-o situație (Chemicon International, Melbourne, Australia), conform instrucțiunilor producătorului. Celulele apoptotice au fost vizualizate prin adăugarea de 0,05% cromagen DAB (Sigma, Castle Hill, NSW, Australia) și secțiunile au fost contracolorate folosind hematoxilină Harris pură. Un minim de trei diapozitive selectate aleatoriu (n = 6) au fost evaluate pentru fiecare animal. Controalele pozitive au fost efectuate prin expunerea preparatelor DNAseI (conform instrucțiunilor trusei). Un diapozitiv a fost folosit pe fiecare diapozitiv pentru analiza TUNEL, în timp ce celălalt a servit drept control negativ (fără adăugarea de TdT).

analize statistice

Datele sunt prezentate ca medie ± SEM și analiza statistică a numărului de foliculi a fost efectuată utilizând software-ul GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, SUA). Datele distribuite în mod normal au fost analizate utilizând un test t student pentru comparații perechi sau ANOVA unidirecțională, iar semnificația a fost determinată de testul de comparație multiplu post-hoc Tukeys. Diferențele au fost considerate semnificative atunci când P