obiecte

abstract

Incidența obezității a crescut în ultimele decenii 1. Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății, obezitatea și supraponderalitatea sunt asociate cu mai multe decese subponderale la nivel mondial. Obezitatea și sindromul său metabolic au devenit probleme de sănătate, sociale și economice. Obezitatea se caracterizează prin acumularea excesivă de țesut adipos în organism 2; în timp ce obezitatea centrală cu țesut adipos se acumulează în principal în depozitele abdominale subcutanate și viscerale 3, 4. Aceste țesuturi adipoase subcutanate sunt puternic asociate cu rezistența la insulină 3, 4, 5, iar persoanele obeze sunt predispuse la complicații metabolice 3 .

Rolul canonic al adipocitelor este de a servi ca regulator pentru menținerea echilibrului energetic în organism 6. Triacilglicerolul (TG) este stocat în picături lipidice citosolice în adipocite în momente de exces de energie și este mobilizat pentru a elibera acizi grași prin lipoliză atunci când este necesară energie sau sub influență hormonală 7. Cu toate acestea, obezitatea este întotdeauna asociată cu un răspuns redus la lipoliza stimulată de catecolamină-8, deoarece la persoanele obeze, lipoliza stimulată de receptorul beta-adrenergic este afectată. Adipocitele de la indivizii obezi au niveluri mai scăzute de activitate adenilil ciclază în condiții stimulate hormonal, comparativ cu adipocitele obezilor de control 9, 10. Studiul a arătat că, după stimularea cu dibutiril AMPc, capacitatea lipolitică maximă a fost mai mică în adipocitele izolate de indivizi obezi decât în ​​adipocite izolate de indivizi neobezi 8. Această constatare sugerează în plus că adipocitele de la subiecții obezi au un răspuns lipolitic afectat la stimularea beta-adrenergică.

Schisandrin B (SchB) este unul dintre cei mai abundenți și activi derivați ai dibenzociclooctadienei care se găsesc în fructele Schisandra chinensis. Schisandra chinensis (Turcz.) Baill este situată în nordul Chinei, Japonia, Coreea și zonele adiacente din Rusia și este utilizată ca medicament pe bază de plante în asistența medicală 18. Până în prezent, s-a raportat că SchB are proprietăți hepatoprotectoare 19, 20, reduce conținutul de lipide hepatice 21, îmbunătățește homeostazia glucozei și crește sensibilitatea la insulină hepatică22. Cu toate acestea, rolul său funcțional în reglarea metabolismului lipidelor adipocitare nu a fost studiat. În acest studiu, am investigat rolul funcțional al SchB în reducerea țesutului adipos subcutanat prin reglarea metabolismului lipidelor adipocite.

Rezultatul

SchB reduce conținutul de lipide al adipocitelor 3T3-L1

SchB este un derivat al dibenzociclooctadienei (Fig. 1a). În primul rând, am folosit analiza UHPLC pentru a confirma puritatea SchB, care a fost de 97% (Fig. 1b).

reglează

Schisandrin B. ( A ) Structura Schisandrin B (SchB); ( b ) cromatograma SchB în analiza UHPLC.

Imagine la dimensiune completă

În acest studiu, am investigat dacă SchB a reglementat metabolismul lipidic în adipocitele albe. Am folosit adipocite 3T3-L1 ca model in vitro. Pentru a determina concentrația sub-citotoxică a SchB pentru experimente, am tratat adipocitele 3T3-L1 cu SchB la diferite concentrații timp de 24 de ore și am efectuat un test MTT. Așa cum se arată în FIG. 2a, IC50 al SchB pentru adipocite 3T3-L1 a fost de 172,8 μM. Am tratat apoi adipocitele 3T3-L1 SchB la 80 μM în ziua a cincea în timpul diferențierii. Interesant, am constatat că SchB reduce numărul de picături de lipide (Fig. 2b) și conținutul de lipide al acestor adipocite (Fig. 2c, d). Aceste date sugerează că SchB reglează metabolismul lipidic în adipocitele 3T3-L1.

SchB reduce conținutul de lipide al adipocitelor 3T3-L1. A ) Test de viabilitate celulară SchB pe adipocite 3T3-L1. ( b ) Picături de lipide în adipocite 3T3-L1 tratate cu SchB (80 μM) 3T3-L1. Cuantificarea colorării lipidelor în martor și adipocite 3T3-L1 tratate cu SchB de către ( c ) Ulei Roșu O a ( d ) Nile Red. Sunt prezentate medii ± SE, n = 3 experimente individuale. * p

SchB induce lipoliza în adipocitele 3T3-L1. ( A ) Un reprezentant occidental prezintă expresiile proteice ale ATGL, HSL și fosfo-HSL în adipocite 3T3-L1 3T3-L1 tratate cu SchB (80 μM) și ( b ) cuantificarea semnalului occidental pentru HSL și p-HSL. ( c ) nivelurile AMPc în adipocite 3T3-L1 controlate și tratate cu SchB. Sunt prezentate medii ± SE, n = 3 experimente individuale. * p a p b p

SchB crește expresia genelor de oxidare a acizilor grași în adipocitele 3T3-L1. A ) Exprimarea acil-CoA oxidazei 1 (Acox1), malat dehidrogenazei 2 (Mdl2), carnitinei palmitoyltransferazei 1 (CPT1), subunității citocrom c oxidazei VIIIb (Cox8b), a acil-CoA dehidrogenazei cu lanț foarte lung (Acadvl) în control și SchB- o (80 μM) adipocite 3T3-L1. Sunt prezentate medii ± SE, n = 3 experimente individuale. * p 7, 12, 13, 14, 16, am generat un model de șoarece de dietă indusă de obezitate (DIO) pentru studii ex vivo și in vivo pentru a investiga efectele SchB asupra metabolismului lipidelor adipocite. În acest studiu, am folosit un model de mouse DIO deoarece acești șoareci DIO nu sunt proiectați genetic. În plus, acestea imită prevalența actuală a obezității, unde majoritatea persoanelor dezvoltă obezitate cu un aport excesiv de calorii. Am determinat modelul mouse-ului DIO prin hrănirea șoarecilor C57BL/6 cu un conținut ridicat de grăsimi (HFD) sau o dietă de control corespunzătoare timp de 12 săptămâni. Așa cum se arată în FIG. 6a, începând cu săptămâna 10, greutățile corporale ale șoarecilor hrăniți cu HFD au fost semnificativ mai mari decât greutățile șoarecilor pe o dietă de control (Fig. 6a). Creșterea în greutate procentuală a fost de 62,06 ± 5,55% pentru șoarecii hrăniți cu HFD și de 33,49 ± 3,41% pentru șoarecii hrăniți cu o dietă martor hrăniți 12 săptămâni.

Șoareci induși de o dietă indusă de obezitate. ( A ) Greutatea corporală și ( b ) diferite greutăți ale depozitelor adipoase la șoareci DIO. Țesutul adipos subcutanat (SAT), țesutul adipos epididimal (EAT), țesutul adipos perirenal (PAT) și țesutul adipos maro (BAT) la șoarecii DIO. Se arată media ± SE, n = 10 șoareci din fiecare grup. * p

SchB crește lipoliza în tampoanele de grăsime separate de șoarecii DIO într-un studiu ex vivo. ( A ) Un western reprezentativ arată expresia HSL și β-HSL în adipocite subcutanate împărțite de la șoareci DIO și ( b ) cuantificarea semnalelor occidentale. NEFA lansat în ( c ) țesut adipos subcutanat (SAT), ( d ) țesut adipos epididimal (EAT) și ( e ) țesut adipos perirenal (PAT) disecat de la șoareci DIO. Se arată media ± SE, n = 5 a experimentelor individuale. * p a p b p

Țesutul adipos subcutanat este puternic asociat cu sindromul metabolic 3, 4, 5. Acumularea de țesut adipos subcutanat la indivizii obezi se datorează parțial rezistenței adipocitelor subcutanate la lipoliză 3. HSL controlează etapa de reglare în lipoliza 11, expresia și activitatea HSL sunt mai scăzute în adipocite subcutanate decât în ​​adipocite din alte depozite de adipos 25. În plus, adipocitele subcutanate au o sensibilitate mai mică la lipoliza indusă de catecolamină și o sensibilitate mai mare la efectele anti-lipolitice ale insulinei în comparație cu alte adipocite 3. Prin urmare, aportul alimentar limitat și exercițiile fizice reduc de obicei țesutul adipos visceral mult mai mult decât țesutul adipos subcutanat 3, 26. În plus, în starea obeză, care este însoțită de rezistența la insulină, lipoliza indusă de catecolamină în adipocitele albe este în general perturbată 15, 27, ceea ce duce și la acumularea de țesut adipos la indivizii obezi.

Studiul nostru a arătat că SchB crește expresia genei de lipoliză și oxidare a acizilor grași la adipocite subcutanate la șoareci DIO, sugerând o nouă abordare terapeutică pentru a reduce țesutul adipos subcutanat la subiecții obezi. Sch B este un compus natural izolat din plante medicinale chinezești netoxice. Studiile la animale au arătat că tratamentul pe termen lung al SchB nu are efecte adverse detectabile28. Datele noastre au arătat, de asemenea, că tratamentul cu SchB nu a provocat un efect advers observabil la șoareci sau a indus apoptoza la adipocite (date neprezentate), sugerând că SchB este un agent terapeutic sigur.

Nivelurile de SchB după administrarea Schisandra au fost măsurate în plasma de șoarece și datele au arătat că SchB a fost maxim în stomac la 15 minute după administrarea intragastrică și a atins concentrații maxime în toate țesuturile la 2 ore după administrare. După injectarea intravenoasă, SchB a fost distribuit în principal în plasmă, ficat și rinichi la 15 minute după injectare. Aceste studii sugerează că SchB nu este toxic la modelele animale. Distribuția SchB în țesutul adipos subcutanat după administrarea intragastrică sau injecția intravenoasă nu a fost studiată 36. În proiectul nostru experimental, am folosit o injecție subcutanată care poate ajuta la localizarea Sch B în țesutul adipos subcutanat pentru a obține efectul maxim anti-obezitate. Doza de 0,4 g/kg la șoareci corespunde unei doze umane de 0,03 g/kg. Pe baza anchetei medicamentelor pe bază de plante (HMC), publicată de Convenția farmaceutică americană (USP), extractul de fructe coapte uscate Schisandra chinensis (Turcz.) Baill conține nu mai puțin de 90% și nu mai mult de 110% din totalul liganzilor, inclusiv \ t schisandrin B (y- schisandrin, C23H28O6), schisandrol B (C23H28O7) și schisandrin A (deoxischisandrin, C24H32O6) pe bază uscată. Studiul a mai arătat că conținutul de lignan din zece probe Schinsandra chinensis colectate din diferite zone din China a fost diferit 37 .

Studiul nostru a demonstrat în mod clar metabolismul lipidelor adipocite reglate de SchB, creșterea activității HSL mediată de PKA, creșterea eliberării de acizi grași și expresia genei de oxidare a acizilor grași la adipocitele subcutanate la șoareci DIO. Datele noastre elucidează utilizarea terapeutică potențială a semințelor Sch B sau Schisandra chinensis care conțin Sch B pentru a reduce obezitatea și, astfel, a condițiilor legate de obezitate asociate cu obezitatea.

Materiale și metode

materiale

Schisandrin B (SchB) a fost achiziționat de la Ningli Technology Co. Ltd. (Kunming, China). Adipocitele 3T3-L1 au fost achiziționate din colecția American Type Culture Collection (ATCC). Mediul esențial modificat Dulbecco (DMEM), serul de vițel fetal, penicilina, streptomicina, soluția de sare echilibrată Hank (HBSS) și Fluo-3/AM au fost achiziționate de la Life Technologies Limited. Anticorpii pentru trigliceridele lipidice adipocite (ATGL), lipaza hormonală (HSL), β-HSL (serina 563 și serina 565), caspaza 3 clivată și GAPDH au fost cumpărate de la Cell Signaling sau Santa Cruz Biotechnology Inc. izoproterenol, reactiv glicerol liber, glucoză, BSA fără acizi grași, ulei roșu O, roșu de Nil, hematoxilină și eozină, dimetil sulfoxid și bromură de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazoliu (MTT ) au fost achiziționate de la Sigma-Aldrich Chemical Co. H89 a fost cumpărat de Calbioch. CAY10499 a fost achiziționat de la Cayman Chemical. Toți solvenții organici au fost de calitate HPLC de la Sigma-Aldrich Chemical Co.

Cultura celulară 3T3-L1 și diferențierea adipocitelor

Adipocitele 3T3-L1 au fost cultivate în mediul esențial modificat Dulbecco (DMEM) conținând 25 mM glucoză și suplimentate cu 10% ser fetal de vițel și 100 UI/ml penicilină G și 0,1 mg/ml streptomicină. Pentru a induce diferențierea, celulele 3T3-L1 confluente au fost tratate cu un cocktail de diferențiere conținând 1 μM dexametazonă, 0,5 mM metilizobutilxantan și 1,7 μM insulină. După 48 de ore, cocktailul de diferențiere a fost înlocuit cu mediu de întreținere care conține insulină timp de 2 zile înainte de a trece la mediu de cultură fără insulină 34 .

Manipularea animalelor

Toate experimentele pe animale au fost aprobate și efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Universității Baptiste a Universității din Hong Kong și au fost aprobate de Comitetul de cercetare umană și animală al Universității și de Ministerul Sănătății, regiunea administrativă specială din Hong Kong. Am cumpărat șoareci masculi C57BL/6 (C57) de 5 săptămâni de la Universitatea chineză din Hong Kong. Șoarecii au fost selectați aleator pentru a avea fie o dietă de control (D12450J Research Diets), fie o dietă bogată în grăsimi (D12762 Research Diets), care a fost utilizată pentru a induce obezitatea. Dieta și apa au fost date ad libitum. Greutatea corporală a fiecărui șoarece a fost înregistrată săptămânal. După o intervenție dietetică de 12 săptămâni, modele stabilite de obezitate indusă de dietă (DIO) au fost utilizate în experimente. Pentru experimentele in vivo, șoarecilor DIO li s-a administrat fie SchB prin injecție subcutanată de 0,4 g/kg/zi în 0,02 ml dimetil sulfoxid sau vehicul singur (0,02 ml dimetil sulfoxid) ca martor timp de 5 zile. Schimbările comportamentale, greutățile corporale și aportul de alimente ale acestor șoareci au fost înregistrate zilnic.

Izolarea adipocitelor

Izolarea adipocitelor din țesutul adipos a fost efectuată așa cum s-a descris în altă parte 38. Pe scurt, țesutul adipos colectat de la șoareci a fost digerat timp de 1 oră la 37 ° C cu colagenază în tampon Krebs-Ringer (KRB; 12 mM HEPES, 121 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4 și 0,33 mM CaCl 2) suplimentat cu 3 mM glucoză și 1% BSA fără acid gras, filtrate printr-o plasă de nailon. Adipocitele au fost îndepărtate din faza superioară după centrifugare. Adipocitele izolate au fost numărate folosind un hemocitometru 39 .

lipoliza

Tampoanele de grăsime de la șoareci DIO au fost excizate și tăiate în probe de 50 mg și incubate la 37 ° C fără agitare în KRB (12 mM HEPES, 121 mM NaCl, 4,9 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,33 mM CaCl 2) conținând 2% grăsime acizi. BSA și 0,1% glucoză 38 în prezența SchB sau vehicul. În acest moment, eliberarea de NEFA și glicerol a fost măsurată în alicote de tampon de incubare folosind kitul LabAssay NEFA (Wako Chemicals) și, respectiv, reactiv de glicerol liber. Pentru a măsura lipoliza în adipocite 3T3-L1, celulele au fost spălate cu KRB și incubate cu KRB suplimentate cu 2% BSA fără acid gras și 0,1% glucoză în prezența SchB sau vehicul. Izoproterenolul a fost utilizat ca un control pozitiv. În acest moment, eliberarea de NEFA și glicerol a fost măsurată în alicote de tampon de incubare utilizând kitul LabAssay NEFA și reactiv glicerol liber. Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare.

Test de viabilitate celulară

Citotoxicitatea SchB pe adipocite 3T3-L1 a fost evaluată prin testul bromurii de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolium (MTT). Celulele din plăcile cu 96 de godeuri au fost tratate cu SchB și 20 pl de soluție MTT (5 mg/ml) au fost adăugate la fiecare godeu după incubare. Plăcile au fost incubate în continuare la 37 ° C timp de 4 ore înainte de adăugarea a 100 pl DMSO. Absorbanța optică a fost determinată la 570 nm folosind un spectrofotometru cu microplacă. Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare.

Ulei colorat Roșu O

Adipocitele 3T3-L1 cu vehicul sau tratament SchB au fost colorate cu soluție de lucru proaspăt preparată Oil Red O timp de 20 minute la temperatura camerei. Pentru a cuantifica colorarea, Red-O uleios a fost extras din celule cu izopropanol conținând 4% Nonidet P-40 și apoi densitatea optică a fost măsurată la 520 nm 40. Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare.

Colorarea roșie a Nilului

Adipocitele 3T3-L1, cu tratament vehicul sau SchB, au fost colorate cu 1 μM Nile Red în soluția de sare echilibrată (HBSS) a lui Hank timp de 15 minute. Probele a 10.000 de celule colorate cu roșu de Nil au fost numărate folosind un citometru de flux (BD Bioscience) 41. Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare.

Colorarea hematoxilinei și eozinei pentru țesutul adipos subcutanat

SAT-urile au fost fixate în 10% formalină tamponată, încorporate în parafină, tăiate în secțiuni groase de 6 μm și colorate cu hematoxilină și eozină. .

Analiza Western blot

Analiza Western blot a fost efectuată așa cum a fost descris. Pe scurt, o membrană de nitroceluloză care transportă proteinele transferate a fost incubată la 4 ° C peste noapte cu anticorpul corespunzător la un raport de 1: 1000. Imunodetecția a fost efectuată folosind un anticorp secundar conjugat cu peroxidază de hrean urmat de un sistem de detectare ECL (Amersham).

Analiza în timp real a reacției în lanț a polimerazei

ARN-ul total a fost extras cu reactiv Trizol (Invitrogen) și tratat cu DNază 1 (Invitrogen). ARN (2 μg) a fost transcris invers cu oligo-dT utilizând transcriptaza inversă M-MLV (Promeg) conform protocolului producătorului. PCR în timp real a fost efectuat utilizând un amestec de reacție SYBR verde într-un sistem ABI 7500 rapid în timp real de PCR (Applied Biosystemsm). Datele privind expresia genei au fost normalizate la beta-actină de control endogen. Nivelurile relative de expresie genică au fost măsurate în conformitate cu formula 2-ACt, unde ACt este diferența valorilor ciclului de prag între ținte și β-actină. Toate probele au fost analizate în trei exemplare.

determinarea AMPc

Nivelurile CAMP în adipocite au fost măsurate așa cum este descris în 42. Pe scurt, adipocitele 3T3-L1 au fost tratate fie cu SchB la concentrația indicată, fie cu vehicul, ca control timp de 6 ore. Adipocitele au fost apoi spălate cu PBS și lizate pentru măsurarea AMPc prin imunoanaliză (BioVision) conform instrucțiunilor producătorului. Cantitățile de proteine ​​adipocite din fiecare grup au fost măsurate prin metoda Bradford. Fiecare tratament a fost efectuat în trei exemplare.

Pregătirea probei pentru LC/MS

Adipocitele 3T3-L1 au fost tratate cu 120 μM SchB sau DMSO ca vehicul timp de 24 de ore. Lipidele au fost extrase din aceste celule pentru studiul lipidomic. La fiecare probă s-au adăugat 0,3 ml KH 2 PO 4 0,5 M, 1,5 ml cloroform și 0,5 ml metanol. După agitare timp de 2 minute și centrifugare la 2000 x g, faza inferioară a fost separată și evaporată sub un curent de azot. Reziduul a fost reconstituit în 100 ui de izopropanol-acetonitril (1: 9, v/v) pentru analiza LC/MS 43. .

Analiza LC/MS și prelucrarea datelor

Mulțumiri

Această lucrare a fost parțial susținută de Fondul de cercetare în domeniul sănătății (HMRF/14-15/03), premiile Universității Baptiste din Hong Kong FRG2/14-15/017, FRG2/16-17/076 și FRG2/16-17/010 până la inovația și tehnologia din Hong Kong (UIM/290) și Consun Pharmaceutical Group Limited.

Material suplimentar electronic

Informatii suplimentare

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.