obiecte

abstract

EBI2 este un receptor cuplat cu proteina G activat de oxisterol 7a, 25-dihidroxicolesterol (7a25HC) și reglează răspunsul anticorpului dependent de celule T și migrarea celulelor B. Am descoperit recent că EBI2 este exprimat în astrocite umane, reglează semnalizarea intracelulară și modulează migrația astrocitelor. Aici, raportăm că tratamentul astrocitelor de șoarece LPS modifică nivelurile de ARNm EBI2 și oxisterol, sugerând că calea de semnalizare EBI2 este sensibilă la provocarea imună mediată de LPS. De asemenea, am constatat că mediul condiționat obținut din astrocitele de șoarece stimulate de LPS induce migrația macrofagelor care este inhibată de antagonistul EBI2 NIBR189. Aceste rezultate demonstrează rolul căii de semnalizare EBI2 în astrocite ca senzor pentru stimularea imunitară și pentru comunicarea cu celule imune înnăscute, cum ar fi macrofagele.

Pentru a determina alte roluri în calea de semnalizare EBI2 în astrocite, am investigat modularea acestuia de către LPS în astrocitele de șoarece. De asemenea, am investigat dacă semnalizarea EBI2 joacă un rol în comunicarea celulară a astrocitelor cu macrofage.

Rezultatul

Mediul condiționat de astrocite de șoarece stimulat de LPS induce migrarea macrofagelor

Există dovezi din ce în ce mai mari că astrocitele produc o serie de molecule de semnalizare (citokine, chemokine, factori de creștere, oxid nitric și altele) care permit comunicarea cu celulele imune înnăscute și, eventual, favorizează migrarea acestora24. Am încercat mai întâi să demonstrăm că astrocitele stimulate de LPS ar putea induce migrația celulelor imune înnăscute și în acest studiu ne-am concentrat asupra capacității lor de a regla migrația macrofagelor. Mediile suplimentate cu 7α25HC (0,01 μM) sau recoltate din LPS (100 ng/ml, 0-24 h) astrocite de șoarece (LPS-Astro-Med) au fost aplicate în camera inferioară a sistemului transwell de migrație xCELLigence® care conține macrofage RAW264. 7 celule din camera superioară (Fig. 1a). Acest LPS-Astro-Med a indus o migrație semnificativă a celulelor macrofage RAW264.7 într-o manieră dependentă de timp comparativ cu astrocitele netratate (192,2% +/- 50,2% după 6 ore, 211,0% +/- 66,5% după 8 ore) (Fig. 1b). Mediile de la astrocite tratate cu LPS timp de 2, 4 și 24 de ore nu au indus migrarea macrofagelor, indicând un răspuns în timp și, de asemenea, indicând faptul că LPS adăugat singur nu a modificat în mod direct migrarea macrofagelor în aceste serii de experimente (Fig. 1b).

joacă

Tratamentul astrocitelor primare de șoarece cu LPS (100 ng/ml) a indus niveluri de 25HC după patru și opt ore ( A ) 7a25HC după opt și 15 ore ( b ) și 7p25HC după patru, opt și 15 ore ( c ). Datele sunt prezentate ca medie +/- SEM, n = 3 - 6. ANOVA unidirecțională cu post-teste Dunnett, * p> 0,05, ** p> 0,01, *** p> 0,001 față de controlul corespunzător.

Imagine la dimensiune completă

EBI2 reglează migrația macrofagelor indusă de mediul condiționat de astrocite de șoarece

În cele din urmă, pentru a determina dacă efectele de migrare observate induse de LPS-Astro-Med au fost dependente de EBI2, mediul a fost suplimentat cu un antagonist EBI2 (NIBR189 ref. [30], 10 μM). Efectele oxesterolilor asupra migrației macrofagelor s-au dovedit a fi parțial inhibate de antagonistul EBI2 (NIBR189), indicând semnalizarea mediată de EBI2 12. În concordanță cu acest studiu anterior 12, antagonistul EBI2 NIBR189 a inhibat efectele 7α25HC asupra migrației macrofagelor (109,5% +/- 57,9%), care a fost aplicat exogen în camera inferioară a sistemului de migrație xCELLigence®. Important, mediile condiționate recoltate din astrocite stimulate de LPS timp de 6 și 8 ore (LPS-Astro-Med) și completate cu un antagonist EBI2 (NIBR189) au atenuat migrația macrofagelor observată (Fig. 4). O tendință de scădere a fost observată pentru acest efect, sugerând o implicare parțială a EBI2 în reglarea migrației macrofagelor (Fig. 4). În general, datele sugerează că astrocitele stimulate de LPS pot induce migrarea macrofagelor și, în plus, că EBI2 poate regla această diafragmă celulară.

Configurarea experimentală poate fi găsită în fig. Atât 7α25HC (0,01 μM), cât și mediul condiționat de astrocite obținut din 6 și 8 ore de șoareci astrocite tratați cu LPS au indus migrarea macrofagelor. Adăugarea unui antagonist EBI2 (NIBR189, 10 μM) la mediu de astrocit de șoarece 7α25HC sau tratat cu LPS a atenuat efectele mediului mediat de astrocite asupra migrației macrofagelor. Datele sunt prezentate ca medie +/− SEM n = 3, ANOVA unidirecțională cu Bonferroni post-teste, * p 21 a arătat că macrofagele cu deficiențe de Ch25h au un fenotip proinflamator și animalele prezintă un curs afectat de EAE, Chalmin și colegii 26 au descoperit că ștergerea Ch25h a atenuat semnificativ evoluția bolii EAE prin restricționarea transmiterii celulelor T CD4 + patogene către sistemul nervos central. Calea de semnalizare EBI2 (în special receptorul și 7a25HC și enzimele sale metabolice) s-a dovedit, de asemenea, că răspunde provocării imune în macrofagele primare derivate din monocite 12. În acest studiu, am examinat semnalizarea și funcția EBI2 în astrocitele șoarecilor și am demonstrat un rol pentru EBI2 în comunicarea celulară dintre astrocite și macrofage.

Aici, am constatat că, ca răspuns la LPS, astrocitele primare de șoarece au redus semnificativ expresia mARN-ului EBI2. Datele noastre au arătat, de asemenea, că astrocitele șoarecilor au reglementat nivelurile de 7a25HC mRNA care sintetizează și degradează enzimele ca răspuns la provocarea cu LPS. Putem specula doar motivele activărilor temporale relativ mai lente ale CYP7B1 și HSD3B7 în comparație cu activarea CH25H, care în prezent rămâne neclară. Important, aceste date sunt în concordanță cu expresia mARN a acestor enzime în macrofagele tratate cu LPS, indicând faptul că expresia CH25H atinge vârfurile după două ore, mARN-ul CYP7B1 poate fi observat în timpul tratamentului cu LPS, iar transcrierile CYP27A1 și HSD3B7 sunt reglate pe parcursul a două sau mai multe ore. ora șase 12 .

Am constatat că reglarea ascendentă a enzimelor sintetice a fost însoțită de reglarea ascendentă a nivelurilor de 7a25HC în mediul tratat cu astrocite de șoarece după tratamentul LPS. Constatările că LPS a crescut nivelurile de 7a25HC în mediul condiționat de astrocite de șoarece au fost asociate cu capacitatea acestui mediu de a promova migrarea macrofagelor. De asemenea, am constatat că mediul condiționat obținut din astrocitele stimulate de LPS a indus migrarea macrofagelor, care a fost parțial atenuată de antagonistul EBI2 NIBR189. Astfel, reglarea căii de semnalizare EBI2 (atât a receptorilor, cât și a enzimelor care controlează nivelurile ligandilor) în astrocite pare să promoveze migrarea celulelor macrofage.

Pe scurt, datele sugerează că moleculele din calea de semnalizare EBI2 sunt sensibile la semnalele pro-inflamatorii și că EBI2 joacă un rol în comunicarea dintre astrocite și macrofage.

metode

Cultură de celule

Toate procedurile pentru animale au fost aprobate de Comitetul de Etică Instituțională (Novartis Pharma, Basel Elveția și Trinity College Dublin, Irlanda). Metodele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare aprobate. Astrocitele șoarecilor 27, 28, 29, 30 și celulele macrofagelor de șoarece (RAW264.7) 12 au fost cultivate așa cum s-a descris mai sus. Înainte de stimulare, astrocitele au murit de foame în mediu fără ser timp de 4 ore. Astrocitele au fost apoi tratate cu LPS (100 ng/ml, Sigma) cu sau fără antagonist EBI2 (NIBR189, Novartis) 31 și/sau 7a25HC (preparat ca o soluție stoc 10 mM în 90% DMSO).

Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei (RT-qPCR)

Cromatografie lichidă de înaltă performanță și spectrometrie de masă tandem (UHPLC-MS/MS)

Teste de migrare

Migrarea macrofagelor de șoarece (RAW264.7) a fost efectuată la 37 ° C și 5% CO 2 într-un incubator umidificat utilizând o platformă de migrație controlată xCELLigence® (Roche Applied Biosciences) cu plăci CIM cu 16 godeuri, așa cum este descris mai sus 22. Pe scurt, migrația celulei de-a lungul rețelei de electrozi de la camera superioară la cea inferioară este măsurată printr-o creștere a impedanței. Camera inferioară a plăcii a fost umplută fie cu mediu tratat cu astrocite, fie fără ser, suplimentat cu 7α25HC (0,01 μM) cu sau fără antagonistul EBI2 NIBR189 (10 μM). Migrarea celulei a fost înregistrată imediat după inserarea plăcii și înregistrarea timp de 2 ore.

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Rutkowska, A. și colab. Calea de semnalizare EBI2 joacă un rol în diafragma celulară dintre astrocite și macrofage. Știință. reprezentant. 6, 25520; doi: 10.1038/srep25520 (2016).

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.