abstract

Scop: Fosforilarea oxidativă se află sub control genetic dublu al ADN-ului nuclear și mitocondrial (ADNmt). Tulburările de fosforilare oxidativă sunt eterogene din punct de vedere clinic și genetic, ceea ce face dificilă identificarea unui defect genetic și a protocoalelor bazate pe simptome care leagă simptomele clinice direct de o genă specifică mtDNA sau de o mutație în urmă. În plus, se estimează că aproximativ 25% dintre pacienții copii și adolescenți cu tulburări de fosforilare oxidativă au mutații în ADNmt, iar o abordare standard de screening pentru mutații și deleții comune explică doar unele dintre aceste cazuri. Prin urmare, am testat o nouă metodă de screening a ADNmt bazată pe CHIP.

Metode: Re-secvențierea MitoChip (Affymetrix) a fost efectuată pe trei probe de testare și pe 28 de probe de pacienți.

Rezultate: Rata apelului a fost în medie de 94%, iar nivelurile de detecție heteroplasmatică au variat între 5-50%. Diagnosticul genetic poate fi făcut la aproape un sfert dintre pacienți cu o producție potențială de 8 secvențe complete de ADNmt la fiecare 4 zile. În plus, au fost identificate o serie de variante neclasificate (UV) potențial patogene.

Concluzii: Disponibilitatea protocoalelor PCR pe termen lung și predominanța substituțiilor cu nucleotide unice în ADNmt fac ca secvențierea CHIP să fie o metodă foarte rapidă și fiabilă pentru screening-ul ADNmt complet pentru mutații.

Principalul

Tulburările de fosforilare oxidativă (OXPHOS) afectează cel puțin 1 din 8.000 din populația totală și aparțin grupului celor mai frecvente boli metabolice moștenite. Manifestările bolii cauzate de defecte OXPHOS pot fi foarte variabile, dar includ de obicei țesuturi cu cerere mare de energie, cum ar fi inima, mușchii, rinichii și sistemele endocrine. Sunt cunoscute mai multe sindroame bine descrise, precum Kearns-Sayre (KSS) și sindromul Pearson, neuropatia ataxie retinită pigmentară (NARP), encefalomiopatia mitocondrială, acidoza lactică și episoadele asemănătoare accidentului vascular cerebral (MELAS) și epilepsia mioclonală (roșu MER) și o. ). Cu toate acestea, defectele OXPHOS se pot manifesta și cu simptome mai frecvente și mai puțin specifice, cum ar fi diabetul de tip 2, surditatea, encefalopatia, miopatia și cardiomiopatia. Tulburările OXPHOS cauzează deci morbiditate și mortalitate semnificative și au un impact larg asupra sănătății publice.

Aproximativ 25% dintre pacienții copii și adolescenți cu tulburări OXPHOS au mutații în ADNmt, dar sunt dificil de găsit datorită eterogenității genetice și clinice. 3 Deoarece numărul mutațiilor ADNmt a crescut la peste 250 și specificitatea clinică rămâne în urmă, protocoalele bazate pe simptome sunt insuficiente și este preferat screeningul pentru ADNmt întreg. 4 MitoChip recent introdus (Affymetrix) este o nouă metodă pentru rezecția ADNmt. 5, 6 În această lucrare, descriem experiența noastră cu screening complet ADNmt la 28 de pacienți cu OXPHOS folosind secvența MitoChip.

MATERIALE ȘI METODE

Pacient și probe de testare

ADN-ul genomic a fost izolat din mușchi conform protocolului lui Mullenbach și colab. ADN de la 3 pacienți secvențați în mod convențional, un pacient cu o deleție heteroplasmatică de 5 bp, 8 și 28 de pacienți cu un fenotip clinic și/sau biochimic al bolii OXPHOS au fost analizați pe MitoChip. Acești pacienți au fost negativi pentru MELAS m.3243A> G, MERRF m.8344A> G și NARP m.8993T> mutații C/G și deleții mari de mtDNA.

MitoChip și procedura experimentală

Analiza datelor

Software-ul Affymetrix GeneChip DNA Analysis Software (GDAS) versiunea 3.0.1.3 beta a fost utilizat pentru a analiza fișierele .CEL folosind setările implicite ale programului. Fișierul raport a fost creat de GDAS cu o listă de variante de nucleotide pentru ambele fragmente de cip comparativ cu secvența de referință Cambridge Revised (RCRS). 4, 11 Diferențele dintre provocările nucleotidice pentru ambele fragmente de cip au fost evaluate manual. Ultimele modificări majore au fost scrise într-un fișier text („fișier de ieșire de ieșire”). A doua analiză a fost efectuată folosind R, un mediu software gratuit pentru calcule statistice și grafică. 12 În analiza R, fiecare cip (fișier .CEL) a fost analizat separat. Nucleotida cu cea mai mare intensitate a semnalului a fost determinată pentru fiecare poziție, ignorând semnalul de fundal. Modificările nucleotidice au fost tipărite într-un fișier text („fișier de ieșire R”). În cele din urmă, „fișierele de ieșire de ieșire” și „fișierele de ieșire R” au fost comparate și combinate, rezultând o listă de variante pentru fiecare eșantion. Discrepanțele dintre ieșirile GDAS și R au fost evaluate manual direct, uitându-se la imaginea cipului sau prin secvențierea convențională. Dacă nu se specifică altfel, în acest document termenul „analiză MitoChip” se referă la analiza combinată a GDAS și R.

Validarea variațiilor și nivelurilor heteroplasmatice

Ambele fire ale fragmentului purtător de variante au fost secvențiate ciclic folosind kitul BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing, analizorul genetic ABI-PRISM 3100 și pachetul software Sequence Analysis 3.7. Nivelul heteroplasmatic a fost determinat de digestia cu restricție specifică mutației. În cazul în care s-a obținut sau s-a pierdut un site de restricție, fragmentele au fost amplificate folosind primerii care înconjoară variația bazei, altfel s-a proiectat un primer de nepotrivire specific pentru a crea un site de restricție. Pentru amplificarea PCR, un primer marcat a fost adăugat la reacție în ultimul ciclu PCR pentru a marca produsele PCR. Produsele PCR etichetate au fost digerate și fragmentele au fost analizate pe un analizor genetic ABI-PRISM 3100 utilizând pachetul software GeneScan Analysis 3.7 (Applied Biosystems). Nivelul heteroplasmatic a fost determinat prin calcularea raportului dintre zona de vârf mutantă sau de tip sălbatic (în funcție de câștigul sau pierderea sitului de restricție prin variația nucleotidelor) și suma ariilor vârfurilor mutante și de tip sălbatic. Secvențele primare și condițiile de reacție sunt disponibile la cerere.

REZULTATELE

Performanța și verificarea MitoChip

Variația ADNmt la 28 de pacienți

Un total de 520 de variații au fost găsite la 28 de pacienți, dintre care 197 au fost substituții de nucleotide unice. Un total de 15 variații heteroplasmatice au fost găsite la un total de 11 pacienți. Patru dintre aceste variații au fost confirmate prin secvențierea și digestia de restricție specifică mutației (m.15939C> T la 7%, m.13513G> A la 14%, m.3243A> T la 34% și m.13042G> A la 84% ); două s-au arătat a fi inserții homoplasmatice cu perechi de baze simple (m.3229_3230insA și m.3158_3159insT); doi păreau să fie fals pozitivi; unul s-a dovedit a fi un polimorfism homoplasmatic (m.15452C> A); celelalte șase nu au fost testate deoarece nu au fost considerate patogene. Dintre toate variațiile găsite, au fost cunoscute trei mutații patogene (Tabelul 1), 114 au fost publicate ca polimorfisme (Tabelul suplimentar 1), 41 nu au avut ca rezultat modificări ale aminoacizilor și au fost cel mai probabil polimorfisme (Tabelul suplimentar 1) și 39 au fost neclasificate (UV), dintre care unele erau probabil patogene (Tabelul 2). Opt variante au fost localizate în moleculele de ARNt (Fig. 1). Mutații patogene cunoscute au fost detectate la trei pacienți, iar UV la 23 de pacienți. Doar polimorfisme au fost detectate la cinci pacienți.

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

bazată

Opt mutații ale ARNt (variante și mutații neclasificate) au fost detectate la 28 de pacienți cu OXPHOS. Variația m.3243A> T în ARNt-Leu1, variația m.4336T> C în gena ARNt-Gln, variația m.5558A> G în gena ARNt-Trp, variația m.5592A> G în ARNt-Ala genă, variația m. 5850T> C în gena tRNA-Tyr, variația m.12308A> G în gena tRNA-Leu2 și variația m.15890C> T și variația m.15939C> T în gena tRNA-Thr. Imaginile sunt adaptate de pe un site web care se ocupă de compilarea genelor ARNt de mamifere (//mamit-trna.u-strasbg.fr/index.html). 32

Imagine la dimensiune completă

UV-urile au fost evaluate pentru protecția evolutivă, pentru semnificația funcțională, prin determinarea efectului asupra ARNt sau proteine ​​și, dacă este disponibil, asupra segregării în familie. Șapte UV-uri au fost localizate în șase gene ARNt (Fig. 1), 11 UV în genele ARNr 12S și 16S, un UV la locul terminator al transcripției mtDNA și 20 UV în genele care codifică proteinele. Dintre cele opt variante de ARNt (Fig. 1), variația m.15939C> T în gena ARNt-Thr a fost heteroplasmatică cu o sarcină de mutație de 7%. Celelalte variante de ARNt au fost toate homoplasmatice sau aproape de homoplasmice (> 98% sarcină mutațională). Două dintre variațiile genelor care codifică proteina au fost heteroplasmatice 84% și 70% pentru m.13042G> A în gena ND5 și m.14258G> A în gena ND6.

Au fost de asemenea detectate inserții de nucleotide unice. Tranziția m.3158A> T heteroplasmatică la CHIP a arătat că secvențierea standard este o inserție de nucleotide unice (m.3158_3159insT). În plus, inserția homoplasmatică a m.3229_3230insA a fost inițial detectată prin analiza MitoChip ca o heteroplasmă m.3229T> O tranziție.

DISCUŢIE

Performanța și verificarea MitoChip

MitoChip în comparație cu alte metode

Tabel în dimensiune completă

Variația MtDNA în 28 de probe clinice

Repetarea nu detectează doar mutații patogene cunoscute sau polimorfisme, ci și UV și factori de risc pentru patologie fără legătură, cum ar fi cancerul, boala Alzheimer sau boala Parkinson. Deoarece semnificația acestui al doilea grup de variații pentru cazurile individuale și familiile lor este încă neclară și factorii de risc nu pot explica patologia primară, este clar că aceste date trebuie tratate cu atenție de către medici. Pacienții ar trebui să fie instruiți cu privire la incertitudinea unor observații și dificultatea în interpretarea unora dintre rezultate. Cu toate acestea, este necesar și nu cântărește diagnosticul genetic. Va fi, de asemenea, o problemă temporară, deoarece vor fi disponibile mai multe informații despre polimorfisme neutre, factori de risc de boală reală și mutații patogene reale ca urmare a eforturilor de secvențiere comună.

CONCLUZIE

Rezechențierea MitoChip este o metodă rapidă, rentabilă și fiabilă, cu capacități de înaltă performanță pentru screening complet al ADNmt. Un sfert dintre pacienții cu OXPHOS pot fi diagnosticați genetic prin această tehnică prin detectarea a trei mutații patogene și trei sau patru mutații patogene probabile la 28 de pacienți, confirmând procentul de mai sus. 3 Datorită numărului tot mai mare de mutații ale ADNmt în combinație cu creșterea eterogenității clinice, resecvențierea MitoChip este metoda preferată pentru screening-ul ADN-mt pentru mutații, mai ales atunci când screening-ul specific simptomului și screeningul doar celor mai frecvente mutații ale ADNmt nu ating.

Mulțumiri

Această cercetare a fost susținută de Fundația Princess Beatrix (numărul grantului: MAR99-0111) și de proiectul MitoCircle (grant UE, al șaselea program-cadru, contract nr. 005260).