obiecte

abstract

Scopul studiului nostru a fost de a dezvolta un test prenatal neinvaziv pentru afecțiuni monogene autosomale recesive și de a demonstra fezabilitatea sa generală și potențialul de integrare clinică.

metode:

Am adoptat o femeie însărcinată și soțul ei, care a avut un copil de proband cu surditate congenitală și a obținut date de secvențiere a zonei țintă dintr-un câmp semicustom care a folosit ADN plasmatic genomic și matern de la trei generații ale acestei familii. O strategie susținută de haplotip a fost dezvoltată pentru a determina dacă fătul a moștenit mutații patogene în gena GJB2 cauzală. Haplotipul parental a fost construit folosind o strategie de trio folosind două procese diferite, și anume procesul de fazare de la bunici și haplotipul asistat și procesul de fazare cu haplotipul asistat de proband. Haplotipul fetal a fost apoi derivat din secvențierea datelor de plasmă maternă și haplotip parental.

rezultatele:

Nivelurile de precizie ale haplotipurilor paterne și materne obținute prin etapizarea haplotipului asistat de bunici au fost, respectiv, 99, 01. 97, 36%, iar procedura de fazare a haplotipului asistat de proband a obținut o precizie ușor mai mică de 98, 73 și 96, 79%. Moștenirea fetală a genei patogene a fost derivată corect în ambele procese.

concluzie:

Studiul nostru arată că strategia testării prenatale neinvazive bazată pe haplotipul pentru afecțiuni monogene are o aplicație potențială în practica clinică.

Genet Med 16 12, 972 - 976.

Principalul

Deoarece ADN-ul fetal al mamiferelor (cffDNA) a fost descoperit în circulația maternă, au fost dezvoltate diferite teste prenatale neinvazive pentru a evita riscul prezentat de procedurile tradiționale de prelevare de probe invazive. 1, 2, 3, 4, 5, 6 Tehnologiile non-invazive bazate pe secvențierea vizează nivelul citogenetic, evoluează rapid și sunt disponibile clinic. 4.5 Cu toate acestea, tehnologiile pentru bolile monogene sunt încă în stadiul experimental de laborator. 7, 8, 9, 10

În studiul nostru anterior 10, am propus un model matematic robust care ar putea restabili cu precizie genotipul fetal și haplotipul fetal într-un singur pas, realizând astfel o caracterizare completă a genomului fetal. Cu toate acestea, acest studiu a fost limitat de cerințele stricte ale eșantionului și nu a fost confirmat de eșantioanele clinice reale.

În acest studiu, s-au prelevat probe de sânge de la o femeie însărcinată și rude apropiate din trei generații ale familiei sale, inclusiv bunicii, părinții și o soră probandă, pentru a efectua teste prenatale neinvazive pentru surditate congenitală. Am construit haplotipuri parentale folosind o strategie de trio și am efectuat cu succes teste prenatale pentru starea fetală, folosind informații obținute fie de la bunici, fie de la probands. Studiul nostru oferă o metodă practică fiabilă de testare prenatală neinvazivă pentru surditate congenitală prin secvențierea plasmatică maternă.

Materiale și metode

Prelevarea de probe și identificarea mutațiilor cauzale

Am adoptat o femeie însărcinată, soția ei și trei generații ale familiei sale, care includeau o fiică probandă ale cărei audiograme prezentau pierderea auzului bilateral sever până la profund. Consilierea genetică a fost oferită familiei, iar testarea prenatală a fost oferită ca opțiune. Datorită riscurilor surdității congenitale a fătului, părinții au optat pentru un test prenatal neinvaziv. Toți participanții la acest studiu au fost acceptați și au acordat consimțământul informat în conformitate cu Declarația de la Helsinki. Aprobările etice au fost furnizate de consiliile instituționale relevante ale tuturor instituțiilor participante. Sângele periferic și lichidul amniotic au fost obținute de la o femeie însărcinată la 17 și 18/19 săptămâni de gestație. Au fost prelevate probe de sânge periferic de la patru bunici pentru construcția de haplotip parental. Reacția în lanț a polimerazei și secvențierea Sanger au fost utilizate pentru analiza de tip mutațional în gena GJB2 ( Tabel suplimentar S1 și figurile S1 și S2 pe net). Tatăl și bunicul patern erau purtători ai c.299delAT. Mama însărcinată și bunicul matern au purtat c.235dC. Sonda a fost un compus heterozigot pentru mutații.

Pregătirea și secvențierea bibliotecii

ADN-ul genomic al ambilor părinți și al tuturor celor patru bunici din sângele periferic a fost fragmentat cu un sonicator. Plasma uterină a fost izolată utilizând un protocol de centrifugare în doi pași. După finalizarea proceselor finale de reparație și de coadă A, adaptoarele au fost ligate la fiecare capăt al fragmentelor de ADN. Codul ADN a fost introdus în fiecare probă în timpul reacției în lanț a polimerazei pentru secvențierea paralelă masivă. Captarea regiunii țintă a fost efectuată pe o matrice NimbleGen EZ concepută personalizat 181, 37 M (conținând întregul exom, polimorfisme 1 M nucleotidă unică (SNP) și regiunea complexă de histocompatibilitate majoră) conform instrucțiunilor producătorului. Bibliotecile post-captură au fost secvențiate utilizând platforma Illumina Hiseq 2000 cu secvențierea finală pereche de 90 bp.

Alinierea și apelarea SNP

Citirile de capăt pereche secvențiate au fost mapate la genomul uman de referință (Hg19, GRCh37) folosind SOAP2. 11 Citirile care ar putea fi mapate pe mai multe situri și care au fost amplificate în timpul procesului de reacție în lanț al polimerazei au fost eliminate. Apoi am făcut un apel SNP folosind software-ul SOAPsnp în zona țintă. 12 Criteriile de filtrare (acoperire> 8 și valoare de calitate> 20) au fost stabilite pentru a asigura acuratețea genotipului genomic.

Estimarea concentrației de ADNcff în circulație

La loci care erau homozigoti la ambii părinți, dar aveau genotipuri diferite, genotipul fetal era obligatoriu heterozigot conform legilor lui Mendel. Astfel, concentrația fracțională a ADN-ului fetal în plasma maternă ar putea fi calculată cu loci pentru care genotipul matern a fost homozigot și pentru care genotipul fetal prezis a fost heterozigot. Poate fi descris ca raportul dintre dublul numărului de alele specifice fetușilor obținut de la tată și numărul total de bază al alelelor. 7, 10

Construirea haplotipului parental

Am creat haplotipul parental folosind o strategie de trio bazată pe legea lui Mendel. Pentru procesul de bunici haplotip asistat (GAHP), a fost construit un haplotip patern cu fiecare trio de părinți și bunici. Pentru procesul de fazare a haplotipului asistat de proband (PAHP), haplotipurile parentale au fost construite cu un trio de tată, mamă și proband.

Concluzia haplotipului fetal

Am utilizat relația de legare obținută din haplotipurile parentale și distribuția bazelor calculate prin secvențierea plasmei pentru a obține fetlotipul congenital. Probabilitățile de combinații de haplotipuri candidate au fost calculate pentru fiecare locus. Conform caracteristicilor de recombinare a procesului de gametogeneză, am calculat probabilitățile de transfer folosind distanța dintre siturile adiacente pentru a crea un model Markov ascuns. În procesul de decodificare a acestui model, am folosit algoritmul Viterbi pentru a găsi cea mai probabilă secvență de stări ascunse și pentru a obține haplotip ereditar și fenomene de recombinare la făt. 13

Rezultatul

Reconcilierea și construcția haplotipului parental

După capturarea zonei țintă

Produsele de îmbogățire de 20 până la 30 de ori au fost supuse unei secvențieri de capăt pereche de 90 bp ( Tabel suplimentar S2 pe net). Toate citirile au fost aliniate cu genomul uman de referință și s-a efectuat un apel SNP. Conform informațiilor SNP, proporția concentrației plasmatice a cffDNA plasmatică a fost estimată la 15,10%.

Haplotipurile parentale au fost construite folosind două strategii: procesul GAHP și procesul PAHP. Folosind GAHP, o regiune de 104, 91 Mb de haplotipuri parentale a fost etapizată cu succes, cu 149.628 markeri candidați distribuiți pe tot genomul. Folosind PAHP, a fost stabilită cu succes o regiune de 104,93 Mb, care conține 168167 markeri candidați.

Deducerea moștenirii haplotipului fetal

În plasma maternă, am generat un lanț de model Markov ascuns folosind haplotipul parental și datele de secvențiere a plasmei ( figura 1 ), în care condițiile au fost ascunse de adevărate genotipuri fetale și condițiile observate au fost amestecuri de adâncimi ale secvenței materne și genotipuri de plasmă fetală. După procesul de decodare, am obținut un haplotip moștenit și evenimente de recombinare la făt. Folosind haplotipul parental obținut de la GAHP, am obținut cu succes 126.600 de fetiți locus și am constatat că haplotipul ereditar fetal a avut o recombinare de 33 de ori, iar mama ereditară a avut 139 de ori. Folosind strategia PAHP, am obținut 146.103 loci cu recombinare de 60 și 181 de ori în haplotipul patern și matern moștenit ( Figura suplimentară S4 și Tabelul S3 pe net).

testarea

Organigrama unei strategii de testare prenatală neinvazivă . ( A ) Harta genetică a acestei familii. b ) diagramă de flux a conductei experimentului și a bioinformaticii. cffDNA, ADN fetal fără celule; HMM, un model ascuns Markov.

Imagine la dimensiune completă

Pentru a estima acuratețea generală a haplotipului fetal prezis, am creat un haplotip standard folosind o strategie trio cu informații despre părinți și celulele lichidului amniotic ( Tabel suplimentar S3 pe net). Folosind GAHP, 98, 15% din loci heterozigoți ai haplotipului patern au fost derivați corect la 67.978 loci și 95, 19% din loci heterozigoți ai haplotipului matern au fost derivați corect la 69.346 loci. Pentru PAHP, rezultatul a fost corect pentru 97, 56% din loci heterozigoți ai haplotipului patern și 94,00% din loci heterozigoți ai haplotipului matern, care este cu aproximativ 1% mai puțin decât rezultatele obținute cu strategia GAHP (online Tabelele S1 și S4 pe net). ).

Evaluarea erorilor de inferență a haplotipului

Haplotipul parental obținut din procesul PAHP conținea recombinare în proband. Astfel, haplotipul fetal derivat din PAHP a fost recombinat de două ori. A arătat evenimente de recombinare mai mari comparativ cu haplotipul fetal derivat din GAHP, ceea ce poate duce la mai multe erori de haplotip în jurul evenimentelor de recombinare. Pentru a investiga în continuare acest efect al evenimentelor de recombinare, am calculat rata de eroare a variațiilor monocleotidice în fiecare regiune de 1 Mb din genom ( Figura suplimentară S4 și tabelul S5 pe net). În procesul GAHP, 23, 87% din erorile din haplotipul patern și 11, 74% din erorile din haplotipul matern au fost localizate la o distanță de 1 Mb în jurul punctelor de întrerupere. Cu toate acestea, în procesul PAHP, 30,12% din erorile haplotip paterne și 23,66% din erorile haplotip materne s-au concentrat în jurul punctelor de recombinare a fracturilor fetale și 9,83% din erorile haplotip paterne și 11, 83% din erorile haplotip. Numărul de erori în haplotipul matern a fost aproape de punctul de recombinare a probandului. Prin urmare, am concluzionat că strategia PAHP a îmbogățit erorile de recombinare de la proband, indicând o precizie mai mică comparativ cu strategia GAHP.

În plus față de efectul evenimentelor de recombinare, erorile de inferență au fost, de asemenea, asociate cu erori de fazare a haplotipului parental și cu concentrații anormale de cffDNA. În procesul de fazare a haplotipului parental, erorile de derivare se pot datora calității scăzute a informațiilor SNP ale bunicilor, părinților și probanților și ar fi suprapuse de procesul de etapizare. Prin urmare, am folosit haplotipurile părinților, probandului și fătului pentru a reproduce procesul de recombinare și am găsit mai multe puncte de recombinare sporadică care arătau doar un semnal de recombinare izolat în regiuni mai mici de 100 kb. În strategiile GAHP și PAHP, aproximativ 29% din erorile au implicat aceste loci, sugerând că determinarea corectă a SNP-urilor în ADN-ul genomic este importantă pentru întregul proces de analiză. Spre deosebire de ADN-ul genomic, cffDNA din plasma maternă a fost fragmentat de degradarea naturală, caracterizată printr-o parte instabilă a genomului uman. Am găsit loci de concentrație extremă de cffDNA (în afara intervalului de încredere de 99% al profilului larg al genomului) și am constatat că aproximativ 30% din erorile abordate.

Testarea prenatală neinvazivă pentru surditate congenitală

Am efectuat teste prenatale pentru surditate congenitală pe baza unui haplotip congenital în gena GJB2. Aici, am definit haplotipurile parentale ca hap0 și hap1 pentru a distinge patogenitatea. În GAHP, alela patogenă paternă moștenită de la bunicul patern se numește f0 iar alela nepatogenă se numește f1. Alela patogenă maternă se numește m0 iar cealaltă se numește m1. Pentru a codifica un model Markov ascuns, moștenirea haplotipului fetal în raport cu gena GJB2 a fost f1 și m0, indicând faptul că fătul a fost un purtător heterozigot al mutației c.235 delC. În PAHP, deoarece probandul era un pacient tipic cu surditate congenitală, am definit alelele parentale moștenite de proband ca hap0, iar celelalte au fost definite ca hap1. În cele din urmă, haplotipul fetal din gena GJB2 a fost, de asemenea, f1 și m0, ceea ce a fost în concordanță cu rezultatul strategiei GAHP ( Figura 2 ). Raportul privind diagnosticul spitalului general China PLA (Beijing, China) ne-a susținut concluzia ( figura suplimentară S3 pe net). În acest studiu, testul genetic s-a bazat pe analiza haplotipului fetal în locul genotipului detaliat.

Rezultatele unui test neinvaziv pentru surditate congenitală . ( A ) Căi moștenite de alele parentale obținute prin strategia GAHP. ( b ) Căi moștenite de alele parentale obținute prin strategia PAHP. ( c ) Vedere mărită a loci în jurul genei GJB2 utilizând atât strategii GAHP, cât și PAHP; ambele strategii arată că fătul a moștenit alelele hap f1 și hap m0. În toate graficele, elementele albastre reprezintă alelele părintești, iar elementele roșii reprezintă alelele materne (culorile deschise indică moștenirea de la bunici, iar culorile închise indică moștenirea de la bunici). Liniile sub zero (linii negre) indică faptul că fătul a moștenit alela patogenă, iar liniile peste zero indică faptul că fătul a moștenit alela benignă. GAHP, haplotip gradat de către bunici; PAHP, faza de haplotip asistată de proband.

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Aproximativ 1% dintre adulți poartă alele mutante. Dintre nou-născuți, alelele mutante reprezintă împreună 20% din mortalitatea infantilă și

10% din internările copiilor. Este necesar să se dezvolte metode de diagnostic eficiente, în special diagnosticul prenatal, pentru a îmbunătăți calitatea vieții societății în ansamblu. Surditatea congenitală este o tulburare genetică clinică obișnuită, cu o incidență de 1-3% la nou-născuți. Testarea precoce a hipoacuziei prenatale poate oferi familiilor mai multe oportunități de instruire și, de asemenea, oferă timp pentru a pune bazele terapiei genetice în viitorul apropiat. 17, 18, 19

În acest studiu, am folosit o strategie pe trei niveluri, fie cu bunicii, fie cu probanții, inclusiv metodele GAHP și PAHP. Ambele metode ar putea identifica haplotipurile parentale corecte pentru a asigura o relație obligatorie pentru a obține un haplotip fetal congenital, deși precizia PAHP a fost mai mică datorită acumulării de recombinare la descendenți. Prin urmare, metoda noastră este potrivită pentru testarea prenatală neinvazivă a familiilor cu boli Mendel, care pot fi derivate din haplotipuri parentale ale bunicilor sau probandilor. Pe de altă parte, secvențierea ADN-ului genomic țintă nu necesită nicio procedură experimentală complicată, cum ar fi metodele descrise anterior susținute de haplotip și este rentabilă dacă este proiectată o matrice adecvată. Timpul de răspuns, inclusiv procesul de eșantionare și testare pe platforma HiSeq2500, poate fi, de asemenea, mai mic de 1 săptămână, iar analiza bioinformatică poate fi efectuată în decurs de o zi, oferind acest tip de procedură pentru aplicații clinice mari. 8, 9

Cu toate acestea, există încă câteva deficiențe ale acestei metode care ar trebui luate în considerare. În primul rând, am creat un haplotip parental bazat pe date de secvență trio într-o singură familie, care limitează grav fezabilitatea metodei noastre pentru familiile monoparentale pentru care aceste date nu sunt disponibile (deși în majoritatea cazurilor clinice, copilul afectat este bolnav). motivul testării prenatale). În al doilea rând, testarea noastră s-a bazat pe relevanța definitivă dintre boală și gena înrudită, deci poate fi utilizată numai pentru bolile pentru care gena patogenă a bolii a fost complet investigată. Prin urmare, metoda noastră se aplică în principal tulburărilor genetice ale lui Mendel. Algoritmi eficienți pentru identificarea mutațiilor de novo nu au fost încă dezvoltați. Există, de asemenea, probleme etice semnificative asociate cu determinarea neinvazivă a genomului prenatal, mai ales pe măsură ce trecem la metode mai cuprinzătoare și convenabile. Cu toate acestea, există multe scenarii clinice în care această abordare ar fi utilă, inclusiv testarea bolilor fatale sau a afecțiunilor care pot duce la alte complicații de sănătate.

În general, am propus o strategie promițătoare de testare prenatală neinvazivă pentru surditate congenitală prin secvențierea masivă în paralel a plasmei materne. Abordarea bazată pe haplotip descrisă în acest studiu poate fi extinsă la testarea prenatală neinvazivă a majorității bolilor monogene.

dezvăluire

XL, HG, FC, YZ, WX, XP, SC, PL, CZ, JC, HJ, XX și WW sunt angajați ai BGI-Shenzhen. Alți autori nu declară niciun conflict de interese.