glandele

  • obiecte
  • metode
  • Soluție de microbule/plasmide și vectori virali
  • Cateterizarea animalelor și a glandelor salivare
  • Afișarea lui Luc in vivo
  • Cuantificarea transferului de gene și analiza statistică
  • histologie
  • Autori
  • Căutați MJ Passineau în:
  • Căutați L Zourelias în:
  • Căutați L Machen în:
  • Căutați PC Edwards în:
  • Căutați RL Benza în:

obiecte

  • Livrarea genelor
  • ecografie
  • Articolul original a fost publicat pe 27 mai 2010

Corecţie: Terapie genică (2010) 17, 1318 - 1324; doi: 10, 1038/gt.2010, 86

De la publicarea acestui articol, autorii au descoperit că există mai multe cazuri în care micrograme au fost publicate în miligrame în secțiunea Metode. Partea corectă a metodei este prezentată mai jos.

metode

Soluție de microbule/plasmide și vectori virali

Microbulele definitive au fost achiziționate ca o suspensie injectabilă de 2 ml și activate cu un dispozitiv Vialmix conform instrucțiunilor producătorului (Lantheus Medical Imaging, North Billerica, MA, SUA). Microbulele au fost utilizate pentru experimente în decurs de 30 de minute de la activare. Un total de 50 μg de pCMV-GL3 (plasmidă care exprimă GL3 Luc construit prin inserarea promotorului citomegalovirusului (CMV) în situl de clonare multiplă de bază pGL3; Promega, Madison, WI, SUA) a fost amestecat cu 50 μg. soluție de microbule, fie o soluție I/O de 100 sau 15% cu soluție salină tamponată cu fosfat.

Pentru transferul de gene mediat de Ad, a fost creat un vector Ad Serotype 5 care nu replică bazat pe sistemul Stratagene AdEasy prin clonarea secvenței GL3 (din vectorul Promega pGL3 Basic) în situl de clonare multiplă al vectorului pShuttle-CMV (Stratagene, La Jolla, CA, SUA). Vectorul navetă a fost recombinat în osul coloanei vertebrale a AdEase, iar vectorul rezultat, Ad-CMVGL3, a fost amplificat și purificat la un titru de 3,5 până la 1012 vp ml-1. Vectorii publicitari au fost furnizați în 50 μg de soluție salină tamponată cu fosfat.

Cateterizarea animalelor și a glandelor salivare

Șoarecii C57BL/6 au fost obținuți de la Jackson Labs (Bar Harbor, ME, SUA) și menținuți în condiții fără patogeni în vivariul Allegheny-Singer Research Institute, cu acces la alimente și apă standard ad libitum. Experimentele și protocoalele pe animale au fost revizuite și aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea animalelor și utilizarea lor de către Allegheny-Singer Research Institute. Transferul genetic în glandele salivare are loc așa cum a fost descris deja de Voutetakis și colegii săi. 4 Pe scurt, animalul a fost anesteziat și plasat într-un cadru stereotactic pentru a menține gura deschisă. Stiloul a fost retras și un cateter subțire din plastic a fost plasat în deschiderea canalului submandibular pe o parte, mișcat de

1 cm și ținut în poziție cu lipici. Un total de 50 μg de soluție vehicul care transportă vectorul de transfer al genei (virus sau plasmidă/microbule) este infuzat în canal pe o parte cu un cateter și pistonul este lăsat la loc timp de 10 minute pentru a permite vectorului să intre în contact cu epiteliile salivei. celule. Cateterul a fost apoi îndepărtat și animalul s-a întors în cușcă pentru a se trezi normal.

În experimentele de transfer al genelor cu ultrasunete, pielea imediat deasupra glandei salivare a fost tratată cu un agent depilator, s-a folosit un gel cu ultrasunete comercial și un emițător de ultrasunete (SoniGene, VisualSoincs Inc., Toronto, Ontario, Canada) a fost în contact direct cu pielea suprapunerii. După perfuzia soluției de plasmidă din microbule, s-au aplicat impulsuri de 4 x 30 s la următorii parametri: 1 MHz, 50% ciclu de funcționare și 2 W cm-2, cu 10 s între impulsuri. După patru impulsuri, iradiatorul a fost retras și animalul a fost lăsat să se odihnească timp de 10 minute înainte de a scoate cateterul.

Luc imagistica in vivo

Șoarecii au fost injectați intramuscular cu 1 ml per g greutate corporală de ketamină (20 g ml-1)/xilazină (100 mg ml-1) amestecate într-un raport de 3: 2. După anestezie, șoarecele a fost injectat intraperitoneal cu D-luciferină substrat (XenoLight D-luciferină de potasiu, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, SUA) la o doză (100 μl la 10 g greutate corporală, 15 mg ml-1 stoc). Șoarecii au fost apoi plasați într-o cameră etanșă la lumină și imaginile au fost generate timp de 1 minut de expunere folosind o cameră de încărcare de legare IVIS Lumina II răcită criogen (Caliper Life Sciences) pentru a cuantifica fotonii emiși spontan de animal. Imaginile au fost pseudo-colorate folosind software-ul Xenogen (Caliper Life Sciences) și s-au suprapus într-o fotografie alb-negru a animalului generată de iluminarea dulapului. Ieșirea vizuală reprezintă numărul de fotoni emiși pe s pe cm 2 ca o imagine pseudo-colorată în care maximul este roșu și minimul este violet.

Cuantificarea transferului de gene și analiza statistică

Imaginile obținute din imagini in vivo au fost analizate folosind software-ul Living Image (Caliper Life Sciences). Fotonii emiși din glanda salivară au fost cuantificați prin definirea unui NI deasupra poziției anatomice a glandei salivare. În majoritatea cazurilor, această rentabilitate a investiției a fost generată automat folosind software-ul „Rentabilitatea automată a conturului investiției” și debitul total (fotoni pe s) a fost măsurat în zona de rentabilitate a investiției. În cazurile în care software-ul nu a putut genera o rentabilitate automată a investiției sau dacă nu a fost prezent un semnal recunoscut, un cerc de aproximativ 0,75 cm în diametru a fost plasat deasupra poziției anatomice a glandei salivare și a fost măsurat debitul total. Am constatat în mod constant că valoarea de fundal de 3 × 104 a fost valoarea de fond în acest sistem. Cu toate acestea, valorile au fost raportate în tabele ca flux total, fără corecție de fond.

histologie

Pentru a investiga diferențele posibile în sialoadenită cauzate de cele două metode acute de eliberare a genelor, am efectuat transferul de gene pe o a doua cohortă de animale folosind metode identice cu cele descrise mai sus, cu excepția faptului că jumătate din animalele din această cohortă erau de sex feminin, sexele fiind distanțate uniform . împărțit între grupuri de anunțuri și grupuri UAGT. Animalele au fost sacrificate după 7 zile și glandele salivare au fost îndepărtate, fixate, încorporate în parafină, tăiate în microtomi și colorate cu hematoxilină și eozină. Un patolog oral orb (PCE) a examinat lamele și a clasificat gradul de sialoadenită pe o scară de la 1 (normal) la 4 (severă, cu distrugerea completă a celulelor acinare) pe baza unei modificări a lui Isacsson și colab. 24

Pentru a examina distribuția spațială a vectorilor de plasmidă/microbulă și expresia transgenă rezultată, am furnizat pCMV-GFP, o plasmidă care exprimă GFP, în același mod ca cel descris mai sus, folosind o soluție de 15% purtător de microbule. Imediat înainte de perfuzia amestecului de plasmidă/microbule și apoi, imagini cu ultrasunete ale glandelor salivare au fost obținute pe un VisualSonics Vevo 770 (VisualSonics Inc., Toronto, Ontario, Canada) cu un cap de scanare RMV-704 care funcționează în modul B la 40 MHz. După 7 zile, animalele au fost sacrificate și glandele salivare au fost îndepărtate, fixate și încorporate în parafină. Secțiunile au fost testate cu anticorp policlonal anti-GFP conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (Abcam, Cambridge, MA, SUA).

Autorii ar dori să-și ceară scuze pentru această greșeală.