obiecte

abstract

Grupul nostru a demonstrat anterior o asociere puternică între activitatea crescută a enzimei CD13 în plasmă și GVHD cronic extins recent (cGVHD) la copii. Deoarece Abs anti-CD13 citotoxice au fost documentate după transplantul de sânge și măduvă osoasă (BMT) în asociere cu infecția cu CMV și cGVHD, am emis ipoteza că CD13 solubil contribuie la patogeneza cGVHD inducând CD13 reactiv Abs și că anti-CD13 Abs poate fi biomarkeri suplimentari pentru cGVHD extins nou diagnosticat. Folosind probe de plasmă colectate prospectiv de la pacienți alogeni pediatrici cu BMT (allo-BMT) cu cGVHD și controale fără cGVHD înscriși într-un studiu terapeutic amplu cu multe instituții din grupul oncologic pediatric cGVHD, am evaluat dacă CD13 solubil a fost corelat cu inducția anti-CD13 Abs . Am constatat că CD13 Ab reactiv este prezent în proporția de pacienți după alo-BMT, dar nu pare să se coreleze cu prezența CD13 solubil. Anti-CD13 Abs, de asemenea, nu a îndeplinit criteriile noastre ca biomarker de diagnostic pentru cGVHD. Aceste date nu confirmă faptul că inducerea CD13 Abs reactiv este un mecanism pentru cGVHD la copii și nici nu face parte din patogeneza cGVHD asociată cu creșterea CD13 solubilă. Rolul exact al CD13 în cGVHD rămâne să fie determinat.

Materiale și metode

obiecte

Probele de sânge periferic au fost colectate și evaluate prospectiv de la subiecții înscriși în studiul clinic oncologic pediatric ASCT0031, un studiu randomizat, controlat cu placebo, dublu-orb, de fază III, care a evaluat două scheme de tratament pentru pacienții pediatrici cu cGVHD extins recent diagnosticat, așa cum este descris mai sus. 7 pacienți înrolați și tratați pentru ASCT0031 au format un grup experimental (n = 52). Pentru controlul reconstituirii imune după alo-BMT, a fost comparată o comparație de timp cu un grup de control (n = 28) la subiecții cu cGVHD, cu zile după alo-BMT în momentul diagnosticului de cGVHD utilizate pentru a împărți grupul experimental în cGVHD inițial (3-8 luni de transplant) sau debutul tardiv al cGVHD (

9 luni după transplant) și comparativ cu pacienții martor fără BMT fără cGVHD de la 6 (timpuriu) și 12 luni (târziu) după BMT. Pentru comparație, au fost evaluați controalele voluntare sănătoase ale donatorilor de sânge netransplantate (n = 6).

Eșantioane evaluate

Sângele periferic a fost colectat de la pacienții cu cGVHD la intrarea în studiu (momentul diagnosticării cGVHD) și de la subiecții martori colectați la 6 și 12 luni (post-transplant). Proba a fost separată în celule și plasmă după centrifugare și depozitată la -80 ° C. Plasma înghețată a fost decongelată într-o baie de apă la 37 ° C și ultracentrifugată (15.000 rpm timp de 5 minute) pentru a îndepărta precipitatul atunci când este gata de utilizare. În urma analizei noastre anterioare a biomarkerilor 7, o minoritate de pacienți nu a mai avut un volum plasmatic adecvat pentru analiza anti-CD13 Ab și nu au fost incluși în această analiză. A fost disponibilă o plasmă adecvată pentru analiza anti-CD13 Ab (45 de probe cGVHD și 26 controale ELISA; 42 probe cGVHD și 23 controale Cellomics, Pittsburgh, PA, SUA).

Analiză enzimatică CD13 (aminopeptidază N) solubilă

Probele de plasmă au fost testate pentru activitatea CD13 solubilă (aminopeptidază N) așa cum s-a descris mai sus. 7 Rezultatele activității CD13 solubile, care au fost publicate în grupul nostru 7, au fost utilizate pentru studii de corelație împotriva anti-CD13 Abs.

ELISA pentru anti-CD13

Celomică pentru anti-CD13

Probele (30 μl) au fost diluate 1: 5 în PBS (120 μl) și adăugate la plăci cu 96 de godeuri care conțin celule endoteliale hemangioendoteliom de șoarece netransfectate (linia celulară EOMA) și incubate timp de 2 ore la temperatura camerei pentru a reduce legarea nespecifică Plăcile au fost centrifugate (800 rpm timp de 5 minute) și s-au colectat 100 pl de supernatant. Supernatantul a fost adăugat la plăci cu 96 de godeuri care conțin celule EOMA transfectate cu plasmidă care exprimă CD13 Ag uman și incubat timp de 2 ore la temperatura camerei. Godeurile au fost apoi spălate de trei ori cu PBS și Ig anti-uman conjugat cu șoarece FITC (specific pentru IgG uman) (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canada) s-a adăugat, incubat timp de 30 de minute și spălat cu PBS. MoAb WM15 a fost utilizat ca martor pozitiv (diluare 1:50 folosind 2 μl WM15 și 98 μl PBS) și isotipul IgG 1 de șoarece MoAb (Ancell, Bayport, MN, SUA) a fost folosit ca un control negativ urmat de FITC conjugat anti- IgG de șoarece 1. Vopseaua HOECHST 33342 (Sigma-Aldrich) la 1 ug/ml a fost utilizată pentru a detecta ADN-ul celulei EOMA. Intensitatea FITC a fiecărei godeuri a fost citită din ArrayScan Reader 4.5 (Cellomics) și intensitatea medie FITC pe celulă utilizată ca marker al abs anti-CD13.

analize statistice

Așa cum s-a definit mai sus, anti-CD13 Abs au fost considerate relevante din punct de vedere biologic și clinic dacă s-au îndeplinit următoarele două criterii: (1) 100% mai mare sau 50% mai mică comparativ cu controlul (± 5%) și (2) semnificația statistică cu un P- valoare de 7 Au fost generate statistici descriptive pentru toate datele folosind versiunea Prism 5 pentru PC (GraphPad Software, San Diego, CA, SUA) sau SPSS (versiunea 15.0, Chicago, IL, SUA). Semnificația modificărilor observate a fost determinată folosind testul t Student și intervale de încredere de 95% ale diferenței exprimate. Toate valorile P.

gvhd

Comparația abs anti-CD13 folosind ( A ) ELISA a ( b ) Celomică între grupurile de subiecți (P = NS pentru toți). ELISA a folosit CD13 porcin ca Ag și OD pentru a măsura relativ anti-CD13 Ab. Testul celomic a folosit CD13 uman ca Ag și intensitatea medie a FITC pe celulă pentru a măsura relativ anti-CD13 Ab.

Imagine la dimensiune completă

Unele probe atât din probele de cGVHD, cât și din cele de control din testul Cellomics au prezentat niveluri ridicate de anti-CD13 comparativ cu voluntarii sănătoși (Figura 1b). Folosind o limită anti-CD13 pozitivă ca intensitate medie a FITC pe celulă plus 2 sd pentru voluntarii sănătoși, nu am găsit o diferență semnificativă în abs anti-CD13 pozitiv între cGVHD timpuriu (14 din 32, 44%) și controalele timpurii (5 din 5) 22, 23%) (diferență 21%; interval de încredere 95%: -3,5 până la + 45,6%). În mod similar, nu a existat nicio diferență semnificativă în cGVHD târziu (7 din 10, 70%) comparativ cu martorii tardivi (5 din 12, 42%) (diferență 28%; interval de încredere 95%: -11,5 până la + 68,1%). Nu s-a găsit nicio asociere între abs anti-CD13 (pozitiv sau negativ) și antecedente de GVHD acut și nici un loc specific de afectare a cGVHD (piele, bucală, oculară, gastrointestinală, hepatică, pulmonară sau musculoscheletală) (datele nu sunt prezentate).

Corelarea abs anti-CD13 cu activitate sCD13

Pentru a evalua dacă CD13 solubil se corelează cu inducția anti-CD13 Ab, s-a efectuat analiza corelației folosind date din Cellomics și activitatea enzimei CD13 solubile. Nu a existat nicio corelație cu activitatea enzimei CD13 solubile și a anti-CD13 Ab (Figura 2; valorile r: 0, 03, -0, 06, -0, 34 și 0, 15 pentru cGVHD timpuriu, controale timpurii, cGVHD tardiv și controale tardive).

Comparația nivelurilor de anti-CD13 Ab în celulele Cellomics cu activitate sCD13 la subiecții cu ( A ) cGVHD ( b ) α-BMT dar nu cGVHD (sânge recoltat la 6 luni după BMT; controale timpurii) ( c ) debut tardiv al cGVHD ( d ) alo-BMT dar nu cGVHD (sânge recoltat la 12 luni după BMT; controale tardive).

Imagine la dimensiune completă

discuţie

După o demonstrație recentă că CD13 solubil se corelează puternic cu cGVHD extins recent diagnosticat la copii, 7 în combinație cu asocierea identificată anterior a anti-CD13 Abs cu infecția CMV 11 și cGVHD 12 după BMT, am încercat să determinăm dacă CD13 solubil indus de CD13 reactiv Abs. ca mecanism care stă la baza cGVHD. Analiza noastră arată că CD13 solubil nu contribuie la patogeneza cGVHD prin inducerea abs-reactiv CD13 și nici nu sunt biomarkeri anti-CD13 Abs pentru cGVHD extins.

Prevalența noastră anti-CD13 Abs (23-70%) a fost în concordanță cu rapoartele anterioare de anti-CD13 Abs (45%) după BMT. În acest studiu anterior, anti-CD13 Ab a fost detectat numai cu viremie sau boală CMV. Datele privind serologia CMV donator/primitor și infecția cu CMV după BMT în studiul nostru nu au fost colectate, ceea ce a făcut imposibilă evaluarea relației dintre anti-CD13 și infecția cu CMV. Anti-CD13 neutralizează infecția CMV prin interacțiunea cu CD1316 asociat cu virion, iar aceste abs apar cu detectarea CMV. Prin urmare, prezența anti-CD13 Abs poate fi asociată cu reactivarea CMV după alo-BMT în contrast cu cGVHD.

Mecanismul CD13 solubil crescut în cGVHD rămâne neclar. CD13 legat de membrană este exprimat pe mai multe tipuri de țesuturi, inclusiv pe cele afectate de cGVHD. 9, 10 CD13 solubil poate fi un produs secundar nespecific al inflamației tisulare intense. Alternativ, aminopeptidaza N este co-exprimată cu molecule MHC II pe un număr de APC profesionale 17, iar modelul secvenței NH2-terminale a peptidelor legate de MHC clasa II poate afecta procesarea in vivo a Ag. 18

În cele din urmă, am demonstrat că CD13 solubil în cGVHD nu induce abs anti-CD13, deși abs sunt prezenți la unii subiecți după alo-BMT. Mecanismul CD13 în patogeneza cGVHD rămâne neclar, dar poate implica medierea răspunsurilor inflamatorii de către celulele T.