urmelor

  • obiecte
  • abstract
  • Principalul
  • Rezultatul
  • Proiectarea și fabricarea proteinelor de fuziune TRAIL
  • Legarea specifică antigenului țintă a scFv-scTRAIL
  • Inducerea țintă a morții celulare restricționate de antigen prin scFv - scTRAIL
  • Inducția mediată de TRAIL-R2 a apoptozei scFv-scTRAIL
  • Timp de înjumătățire plasmatică scFv - scTRAIL
  • Efectele tumorale asupra carcinoamelor de colon uman la șoareci goi
  • discuţie
  • glosar

obiecte

  • cancer
  • farmacodinamica
  • farmacocinetica
  • Terapia cu proteine ​​recombinante

abstract

Principalul

Recent, a fost descrisă o moleculă de TNF cu un singur lanț constând din trei monomeri TNF fuzionați cu linkeri peptidici scurți care prezintă stabilitate sporită și activitate antitumorală. Am propus o variantă analogă a unui singur lanț polipeptidic TRAIL (scTRAIL) care a fost utilizat pentru a construi proteina de fuziune scFv-scTRAIL pentru țintirea tumorii. Am comparat activitatea biologică a acestei proteine ​​de fuziune cu scTRAIL ne țintit în modele de tumori in vitro și in vivo. Vom arăta aici că proteina de fuziune scTRAIL orientată spre antigenul tumoral a prezentat o activitate apoptotică mai mare împotriva scTRAIL in vitro, cu efect predominant al semnalizării TRAIL-R2 asupra celulelor de carcinom de colon Colo205. Studiile in vivo pe un model de xenogrefă tumorală de șoarece au confirmat un răspuns semnificativ mai mare la proteina de fuziune scTRAIL specifică ErbB2 orientată spre tumoare.

Rezultatul

Proiectarea și fabricarea proteinelor de fuziune TRAIL

Pentru a crea o moleculă TRAIL cu un singur lanț, am urmat principiul de proiectare descris pentru scTNF 20 și am fuzionat covalent trei monomeri TRAIL, fiecare constând din domeniul extracelular al TRAIL (aa 95-281) prin intermediul a doi linkeri peptidici care conțin patru repetări ale secvenței GGGS. (Figura 1a). Eticheta FLAG N-terminal a fost adăugată pentru a facilita purificarea și analiza. Apoi, prin fuzionarea în continuare a capătului N-terminal al unui fragment de anticorp cu lanț unic (scFv) recunoscând epitopul FRP5 în domeniul extracelular al ErbB2, 21, am creat o proteină de fuziune scTRAIL specifică ErTB2 (Figura 1a).

Analiza biochimică a scTRAIL și scFv - scTRAIL. A ) Schema proteinelor de fuziune scTRAIL utilizate în acest studiu. L, peptidă lider; scFv, fragment de anticorp cu lanț unic specific ErbB2 uman; F, marca FLAG; TRAIL, TRAIL uman (aa 95–281). ( b ) ScTRAIL purificat (banda 1) și scFv-scTRAIL (banda 2) au fost analizate prin SDS-PAGE (10%, condiții reducătoare), urmată de analiza imunoblotului (stânga, 250 ng proteină/banda) sau colorarea cu argint (dreapta, 1 μg proteine)./bar). Pentru imunoblotare s-au utilizat anticorp monoclonal anti-FLAG M2 și anticorp secundar conjugat cu fosfatază alcalină. ( c ) Variantele TRAIL au fost separate prin filtrare pe gel pe o coloană BioSuite250. Liniile punctate indică timpul de reținere a standardelor de greutate moleculară ale apoferritinei (443 kDa), β-amilazei (200 kDa), albuminei serice bovine (66 kDa) și anhidrazei carbonice (29 kDa). Fracțiile colectate au fost analizate prin imunoblotare ca în b . Pentru fracțiile scTRAIL 1-9 (fiecare a doua fracție; prima parte), fracțiile 11-16 (a doua parte) și fracțiile 19-26 (fiecare a doua fracție; a treia parte) au fost imunoblotate. Pentru scFv-scTRAIL, fracțiile de la 8 la 24 au fost imunoblotate

Imagine la dimensiune completă

Atât scTRAIL, cât și scFv-scTRAIL au fost purificate prin cromatografie de afinitate pe agaroză monoclonală anti-FLAG M2 din supernatantul celulelor HEK293 transfectate stabil cu un randament de aproximativ 1 mg proteină per litru de supernatant pentru cultura celulară. Analiza imunoblot și SDS-PAGE (Figura 1b) ale proteinei purificate au arătat benzi proteice individuale cu o greutate moleculară de -70 kDa pentru scTRAIL și

100 kDa pentru scFv-scTRAIL, care corespunde greutăților moleculare calculate așteptate de 71 și respectiv 98 kDa. Analiza filtrării pe gel a arătat organizarea monomerică a ambelor variante scTRAIL, corespunzătoare, în raport cu fragmentul TRAIL, trimerului ne-asamblat covalent al moleculei TRAIL recombinante convenționale (Figura 1c). Greutățile moleculare derivate din SEC au fost ușor mai mici comparativ cu greutatea obținută din SDS-PAGE (Figura 1b), care nu a rezultat din degradare, după cum sa verificat prin analiza imunoblotă a fracțiilor grupate (Figura 1c). În preparatul scTRAIL, fracția minoră eluată în SEC la o greutate moleculară aparent mai mare, adică potențial conținând complexe agregate, nu a prezentat o activitate biologică disproporționat de mare, așa cum s-a constatat la compararea activității citotoxice a fracțiilor 2 și 15, ținând cont de proteinele sume (datele nu sunt prezentate).

Legarea specifică antigenului țintă a scFv-scTRAIL

Pentru a analiza legarea specifică a scFv-scTRAIL la celulele pozitive ErbB2, s-a efectuat analiza citometriei în flux. Analiza expresiei ErbB2 a confirmat un nivel de expresie moderat versus scăzut pentru celulele de carcinom de colon Colo205 și celulele fibrosarcomului HT1080 (Figura 2a), comparativ cu celulele SKBR3, despre care se știe că exprimă foarte mult proteina ErbB2 (datele nu sunt prezentate). Incubația celulelor Colo205 și HT1080 cu proteina de fuziune a dezvăluit legarea specifică la celulele pozitive ErbB2 (Figura 2a și b) comparativ cu incubația cu scTRAIL ne-țintă, rezultând doar un semnal fluorescent slab, fie prin detectare anti-TRAIL (Figura 2a ) sau cu anticorpi anti-FLAG (datele nu sunt prezentate). Deoarece legarea TRAIL homotrimerică marcată cu FLAG a arătat semnale slabe similare (datele nu sunt prezentate), aceasta ar putea reflecta niveluri scăzute ale expresiei receptorului TRAIL (TRAILR) pe celulele țintă examinate și/sau sensibilitate insuficientă a testelor FACS. Legarea specifică ErbB2 a fost confirmată folosind proteinele de fuziune TRAILR1 și R2-Fc pentru a detecta legarea scFv-scTRAIL de celulele țintă (Figura 2b) și concurența cu anticorpii anti-ErbB2 (FRP5). Acest lucru a dus la inhibarea aproape completă a legării scFv-scTRAIL la linia celulară ErbB2-pozitivă (Figura 2b).

Imagine la dimensiune completă

Timp de înjumătățire plasmatică scFv - scTRAIL

Pentru a evalua proprietățile farmacocinetice ale scFv-scTRAIL comparativ cu scTRAIL, probele de ser au fost colectate după injectarea intravenoasă (iv) de 400 pmol la șoareci Balb/c individuali. În ambele cazuri, concentrațiile serice relative reprezentate în timp au fost bine adaptate la curba de regresie exponențială în două faze de declin. În termen de 20 de minute de la injectare, ambele variante TRAIL au prezentat o cinetică similară cu un timp de înjumătățire plasmatică de ∼ 35 minute (t 1/2 α). În momentele ulterioare, s-a găsit o ușoară, dar semnificativă diferență de biodisponibilitate cu timpii de înjumătățire (t ½ β) de 160 și 124 min și AUC 11 191 și 8125 pentru scFv-scTRAIL și scTRAIL (Figura 5a). Astfel, proteina de fuziune specifică ErbB2 a fost reținută mai eficient în fluxul sanguin, ceea ce ar putea afecta pozitiv activitatea terapeutică.

Imagine la dimensiune completă

Efectele tumorale asupra carcinoamelor de colon uman la șoareci goi

În concluzie, datele noastre oferă dovezi că pot fi generate proteine ​​de fuziune TRAIL cu un singur lanț bioactiv. Mai mult, fuziunea cu un anticorp scFv specific țintă are ca rezultat o creștere dependentă de țintă a citotoxicității mediate TRAIL in vitro, probabil datorită activării eficiente TRAIL-R2 și îmbunătățește activitatea antitumorală in vivo. În consecință, acest concept de proiectare reprezintă o strategie promițătoare pentru a spori acțiunea antitumorală a TRAIL și pentru a minimiza acțiunile potențiale nedorite în afara țintei pe țesuturile normale.