obiecte

abstract

Funcția genelor de biosinteză a hatomarubiginei a fost analizată prin expresia heterologă a grupului de gene hrb. Streptomyces lividans care poartă un grup de gene format din 25 de gene (hrbR1 - hrbX) cu hrbY sa dovedit a produce toate hatomarubiginele cunoscute, inclusiv hatomarubigina D, care are o anguciclină dimerică unică cu o legătură metilenică. În acest sistem de expresie heterolog, întreruperea genelor a fost utilizată pentru a analiza funcția hrbF, o genă fără omologie cu genele de biosinteză ale anguciclinei cunoscute. Noul metabolit a fost detectat în mediu fermentat de S. lividans care exprimă gene hrb fără hrbF și a fost desemnat hatomarubigină F. Acest compus a fost identificat ca 5-hidroxiatomarubigină E prin analiza spectroscopică RMN, indicând faptul că HrbF reglează regiospecificitatea enzimelor oxidative.

Hatomarubiginele A, B, C și D (Figura 1), substanțe care sunt reversibile la mai multe medicamente, au fost produse de Streptomyces sp. 2238-SVT4. 1 Hatomarubigina E și rubiginonă B2 au fost de asemenea găsite în bulionul fermentat ca intermediari biosintetici. Acești compuși aparțin grupului de angucicline, 3, 4, care se caracterizează prin aceea că conține un schelet modificat de benz [a] antrachinonă. Printre acestea, hatomarubigina D a fost o anguciclină dimerică unică cu o legătură de metilen. În studiul nostru anterior, 5 hatomarubigine, altele decât hatomarubigina D, au fost produse de Streptomyces lividans care poartă un grup de gene format din 25 de gene (hrbR1 - hrbX) pentru a identifica gena clusterului de cocoașă (Figura 2) ca gene de biosinteză a hatomarubiginei. Un astfel de sistem de expresie heterolog este util pentru analiza funcțională a genelor necunoscute dintr-un cluster. În acest studiu, toate hatomarubiginele cunoscute, inclusiv hatomarubigina D, au fost produse prin expresia heterologă a genelor 25 hrb cu hrbY, iar hatomarubigina F, un nou membru al familiei hatomarubigine, a fost izolată din miceliul de S. lividans fermentat care purta hulul lipsit de hrb .

funcțională

Structuri ale hatomarubiginelor A la F și rubiginonei B2.

Imagine la dimensiune completă

Grupa genică de biosinteză hatomarubigină de la Streptomyces sp. 2238-SVT4. Săgețile indică fragmente de ADN utilizate pentru exprimarea heterologă. Căsuțele gri indică gene omoloage ale genelor de biosinteză ale anguciclinei cunoscute.

Imagine la dimensiune completă

rezultate si discutii

Exprimarea unui grup de gene hrb cuprinzând hrbY în S. lividans

Studiul nostru anterior a identificat HrbY ca o enzimă care poate converti hatomarubigina C în hatomarubigina D în prezența metilcobalaminei. Pentru a confirma funcția in vivo a HrbY, am construit pWHM3-HR-Y, o plasmidă care transportă 25 de gene hrb (hrbR1 - hrbX) cu hrbY. Toate hatomarubiginele cunoscute, inclusiv hatomarubigina D, au fost detectate prin analiza HPLC a bulionului de S. lividans fermentat purtând pWHM3-HR-Y, deși genele S. bividans care exprimă gene de cocoașă fără cocoașă nu au produs hatomarubigină D (Figura 3). Aceste rezultate au arătat că HrbY este funcțional in vivo și că grupul de gene al biosintezei hatomarubiginei există în regiune de la hrbR1 la hrbR3, o genă omologă pentru regulatorul nuclear (61% identitate). 5

Analiza HPLC a extractului micelial S. lividans care transportă pWHM3-HR5 ( A ); pWHM3-HR-Y ( b ); pWHM3-HR-YF ( c ) și pWHM3-HR-YFF-F ( d ). 1: hatomarubigín F, 2: hatomarubigină B, 3: hatomarubigin A, 4: hatomarubigină C, 5: hatomarubigin E, 6: hatomarubigin D.

Imagine la dimensiune completă

Expresia genei cluster cluster hrb nu are hrbF în S. lividans

Clusterul genelor de cocoașă conține mai multe gene fără omologie față de genele cunoscute pentru biosinteza anguciclinei (Figura 2). Dintre acestea, hrbF codifică o proteină de 234-aminoacizi care prezintă o asemănare mică cu biosinteza antibioticelor monooxigenază S. griseus NBRC13350 SGR_5610 (identitate 34%) și biosinteza ubiquinonă/menaquinonă metiltransferază din Caulobacter crescentus CB15 (identitate 34%). Pentru a examina funcția hrbF, am construit pWHM3-HR-YF, o plasmidă care poate exprima grupul de gene hrb lipsit de hrbF. Miceliul S. lividans fermentat care transportă pWHM3-HR-YF conținea toate hatomarubiginele, indicând faptul că hrbF nu este esențial pentru biosinteza hatomarubiginei. Atunci când profilurile HPLC au fost comparate cu profilurile din S. lividans care exprimă întregul grup de gene zhb hrb, a fost detectat un nou metabolit și vârful a dispărut în bulionul transformatorului, care a fost introdus în hrbF (Figura 3). Această substanță a fost identificată ca un nou membru al familiei hatomarubiginei prin analize spectroscopice și a fost desemnată hatomarubigina F ( 1 ).

Determinarea structurii hatomarubiginei F (1) \ t

Tabel în dimensiune completă

Analiza RMN a hatomarubiginei F ( 1 ). Liniile îngroșate indică rețele COSZY, iar săgețile indică HMBC.

Imagine la dimensiune completă

Streptomyces sp. 2238-SVT4 a produs rubiginonă B2, care poate fi convertită în hatomarubigine A și B prin oxidare la C-6 și C-11. În grupul hrb, două gene tandem, hrbW și hrbX, care codifică oxidoreductaza și oxigenaza, sunt implicate în 11-hidroxilare. Oxigenaza putativă responsabilă de 6-hidroxilare este atribuibilă hrbG. Întreruperea hrbF a cauzat oxigenarea în poziția C-5 anormală și a redus producția de hatomarubigină A (Figura 3), sugerând că HrbF controlează regiospecificitatea acestor enzime oxidante.

Sectiunea Experimentala

Tulpinile bacteriene și manipularea ADN-ului

Condiții medii și de creștere Streptomyces sp. 2238-SVT4 și S. lividans TK23 au fost descrise mai sus. 1.5 Escherichia coli XL1-blue MRF 'și JM110 au fost crescute în mediu LB suplimentat cu 100 ug ml-1 ampicilină. ADN polimeraza KOD-plus (Toyobo, Osaka, Japonia) a fost utilizată pentru amplificarea PCR conform instrucțiunilor producătorului. Au fost efectuate alte proceduri generale așa cum este descris în Sambrook și colab. 8

Construcția plasmidelor pentru exprimarea clusterelor

Fragmentul de 19,8 kbp constând din hrbR1 la hrbS (HR01) a fost construit așa cum s-a descris mai sus. Un fragment de 5,2 kbp constând din hrbT în hrbX (HR02) a fost amplificat de la Streptomyces sp. 2238-SVT4 ADN genomic folosind primerii cu situri suplimentare Nsi I și Nhe I (5'-TGCATGCATGTGCGAGAGCGCTGGACGCACGC-3 'și 5'-ACCGCTAGCTCAGACGGACAGCAGCCCGCGTGC-3'). Fragmentul de cocoașă de 1,1-KBP (HR03) a fost amplificat din ADN genomic folosind primerii cu situri suplimentare NheI și HindIII (5'-ACCGCTAGCATGAGTGCAACAGTCGCGGTCGTC-3 'și 5'-ACCAAGCTTTCAGCCGGCGGTGGGACCGAACTG-3'). HR01 scindat Xba I/Nsi I, HR02 scindat Nsi I/Nhe I, scindat HR03 cu NheI/Hin dIII și scindat pWHM3 scindat XbaI/Hin dIII au fost legați la constructul pWHM3-HR-Y, plasmidă purtând hrbR1 la hrbX s. În această plasmidă, hrbA la hrbY poate fi transcrisă.

Întreruperea hrbF a fost efectuată așa cum este descris mai jos. Fragmentul Not I/Pst I de 3,1 kbp conținând hrbF a fost donat în pBluescript II SK (+) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA). Un fragment de 1,2 kbp în amonte de hrbF a fost amplificat din plasmidă folosind primer R13 M13 și un primer cu un alt site Bln I (5'-AACCTAGGCGTCTTTCACTCCCGGTGTCGTCG) și digerat cu NotI și Bln I. Un fragment de 1,2 kbp în aval de hrbF a fost amplificat folosind primer M13 M4 și grund cu site-ul Bln I suplimentar (5'-AGCCTAGGGCGCGCAGGTCGGCCCCAGAAGGA-3 ') și digerat cu Pst I și Bln I. Aceste două fragmente au fost ligate la Not I/Pst I digerat pBluescript II SK (+), HrbF-șters Fragmentul kbp obținut prin digestia Not I/Pst I a plasmidei a fost schimbat cu fragmentul original de 3,1 kbp Not I/Pst I al pWHM3-HR-Y pentru a construi pWHM3-HR-YF. Fragmentul hrbF de 0,7 kbp a fost amplificat din ADN genomic folosind primerii cu site-uri Bln I suplimentare (5'-GACCTAGGATGCCTGTAGCCTCCGACGCCCCA-3 'și 5'-CGCCTAGGTCAGTCGGCTGTCTTCTCCAGCGC-3') și p1 HbMG a fost din nou inserat în hrb aceeași orientare către construcția pWHM3-HR-YFF-F pentru analiza complementară a hrbF .

Expresia heterologă a genelor de biosinteză a hatomarubiginei

Plasmidele de expresie trecute prin E. coli JM110 au fost introduse în S. lividans TK23. Transformanții au fost inoculați în mediu de inoculare conținând 10,3% zaharoză, 3,0% glucoză, 1,5% Bacto Soia, 0,1% glicină, 3 mM CaCl 2, 5 mM MgCl 2 și 10 μg ml-1 tiostrepton (pH 7, 2). După incubare pe un agitator alternativ la 27 ° C, 2 ml de cultură de inocul au fost transferați în baloane Erlenmeyer de 500 ml cu 50 ml de produse conținând 2,5% amidon solubil, 1,5% făină de soia, 0,2% drojdie uscată, 0,2% 4% CaCO 3 și 10 μg ml-1 tiostrepton (pH 6, 2). Fermentarea a fost efectuată pe un agitator rotativ la 27 ° C timp de 2 până la 3 zile. Bulionul de fermentație a fost centrifugat și miceliul a fost extras cu acetonă. După evaporare, concentratul apos a fost extras cu acetat de etil. Extractul a fost analizat prin HPLC cu fază inversă (YMC-Pack R-ODS-7, 4,6 mm x 250 mm; YMC, Kyoto, Japonia) cu 80% metanol. Vârfurile de absorbție pentru hatomarubigine au fost detectate la 470 nm.

Izolarea hatomarubiginei F (1)

Miceliul se obține prin centrifugarea unui mediu fermentat de 2 zile (5 litri) de S. lividans TK23 care transportă pWHM3-HR-YF și se extrage cu acetonă. Extractul a fost concentrat și împărțit între acetat de etil și apă. Stratul organic a fost evaporat și dizolvat în cloroform. Precipitatul a fost dizolvat în metanol prin adăugarea a 10 volume de hexan și filtrat. Filtratul a fost supus la HPLC (YMC-Pack D-ODS-7, 20 mm x x 250 mm; YMC) cu 80% metanol-0,2% acid fosforic. Unul dintre vârfurile majore (volumul de retenție: 280 mL) a fost în continuare purificat prin HPLC (YMC-Pack D-ODS-7) cu 75% metanol conținând 5 mM hidrogen citrat de sodiu. Fracția principală (volum de retenție: 395 ml) a fost evaporată și concentratul apos a fost extras cu acetat de etil. Extractul a fost spălat cu apă și concentrat la sec pentru a da o pulbere portocalie 1 (1,2 mg).

Proprietățile fizico-chimice ale hatomarubiginei F (1) \ t

p.t. 276-278 ° C; EI-MS de înaltă rezoluție m/z 340.0948 (M +, calculat pentru C19H16O6, 340.0947); UV λ max (λ) 224 nm (20.300), 287 nm (18.000), 475 nm (6800) în metanol, 226 nm (22.000), 287 nm (20.000), 474 nm (7.000) în 01 M HCl-metanol, 240 nm (14.200), 310 nm (15.000), 534 nm (8300) în 0,01 M NaOH-metanol; IR (ATR) νmax 3438, 3127, 1619, 1568, 1449, 794 cm-1 .

Măsurători spectroscopice

Spectrele de masă au fost obținute pe un spectrometru JMS-SX102A (JEOL Ltd., Tokyo, Japonia) în modul EI. Spectrele UV și IR au fost măsurate pe spectrometrele Shimadzu UV-1700 și JASCO FT/IR-410. Spectrele RMN au fost obținute în DMSO-d6 pe un spectrometru JEOL JNM-LA400 cu 1 H-RMN la 400 MHz și 13C-RMN la 100 MHz. Schimbările chimice sunt raportate în ppm față de DMSO la 2,49 ppm pentru 1 H-RMN și la 39,5 ppm pentru 13 C-RMN.