efectele

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • AMPc exogen îmbunătățește fenotipul asociat cu îmbătrânirea la șoareci mai în vârstă
  • AMPc imită efectele restricției calorice prin creșterea nivelului de sirtuină
  • Tratamentul CAMP îmbunătățește metabolismul grăsimilor pentru a reduce caloriile mimice
  • AMPc propagă sirtuina pentru a preveni deteriorarea oxidativă și îmbătrânirea celulelor
  • cAMP leagă direct SIRT1 și SIRT3
  • discuţie
  • Proceduri experimentale
  • Animale și diete
  • Cultura și tratamentul celular
  • Teste comportamentale
  • Măsurarea conținutului de carbonil 8
  • Măsurarea nucleotidelor
  • Măsurători biochimice
  • Observarea secțiunilor histochimice
  • Analiza proteinelor
  • Rezonanță plasmatică de suprafață
  • Analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

abstract

Adenozin monofosfat ciclic (AMPc) joacă un rol important în multe procese biologice ca al doilea mesager, iar tratamentul AMPC a prelungit durata de viață a Drosophila melanogaster de tip sălbatic. Studiul nostru a arătat că AMPc exogen a îmbunătățit fenotipurile legate de îmbătrânire prin creșterea nivelului de sirtuine, care a împiedicat tulburările metabolice să imite efectul caloriilor. Experimentele in vitro au arătat că AMPc s-a legat direct de SIRT1 și SIRT3 și ulterior și-a crescut activitatea. Aceste descoperiri sugerează că AMPc încetinește procesul de îmbătrânire și este un bun candidat pentru a imita restricția calorică. Cercetarea noastră oferă o strategie terapeutică promițătoare pentru bolile legate de îmbătrânire cauzate de o tulburare metabolică.

Restricția calorică este o intervenție eficientă pentru a prelungi atât viața medie, cât și cea maximă 1. Cu toate acestea, efectul anti-îmbătrânire al aportului de calorii necesită o reducere a aportului caloric de aproximativ 30 până la 40%, ceea ce este insuportabil pentru majoritatea oamenilor. Mulți cercetători au încercat să găsească un medicament care să imite restricția calorică care are efecte anti-îmbătrânire fără a reduce aportul de energie, cum ar fi resveratrolul 2. Un studiu recent a raportat că resveratrolul are efecte anti-îmbătrânire prin inhibarea hidrolizei AMPc. Rolipramul, care inhibă în mod specific hidroliza AMPc, a avut efecte similare cu resveratrolul 3, sugerând potențialul AMPc ca candidat mimetic cu restricții calorice. Un alt studiu a arătat că durata de viață a Drosophila melanogaster de tip sălbatic după tratamentul cu AMPc 4 a fost semnificativ crescută, sugerând că AMPc poate juca un rol cheie în întârzierea procesului de îmbătrânire a organismelor.

SIRT1 a fost propus ca o proteină anti-îmbătrânire și activarea acestuia duce la beneficii pozitive pentru sănătate pentru mai multe organisme 5. S-a raportat că lipsa legării CAMP la elementele responsive (CREB) reduce expresia SIRT1; CREB reglează direct transcrierea Sirt1 în celulele neuronale prin legarea la cromatina 6 Sirt1. Un studiu recent a arătat că cAMP a activat calmodulin kinaza kinaza II (CaMKKII) pentru a crește nivelul de fosforilare AMPK, promovând astfel producția de NAD + și activarea SIRT1 3. Un alt studiu a arătat că activarea căii de semnalizare cAMP-PKA a dus la fosforilarea rapidă a SIRT1 fără a modifica nivelul NAD + 7. Aceste descoperiri au evidențiat relația dintre AMPc și SIRT1 în căi diferite și au sugerat că AMPc poate fi un activator specific al SIRT1 și imită efectul anti-îmbătrânire al restricției calorice.

SIRT3, ca deacetilază omologă a SIRT1, se găsește în principal în mitocondrii, unde reduce cantitatea de specii reactive de oxigen (ROS) responsabile de inducerea îmbătrânirii celulare 8, 9. În plus, există un sistem independent de reglare a producției și degradării AMPc în mitocondrii pentru a controla generarea ROS 10, 11, dar nu a fost raportat dacă AMPc poate regla SIRT3 pentru a reduce stresul oxidativ.

AMPc efectuează o varietate de procese metabolice legate de metabolismul hormonal ca un al doilea mesager, iar răspunsul AMPc pentru mulți hormoni diminuează odată cu îmbătrânirea 12, sugerând că AMPc ar trebui să joace un rol important în reglarea procesului de îmbătrânire. Studiul nostru a arătat că administrarea de AMPc exogen (dibutiril ciclic adenozină, db-AMPc) a crescut nivelul proteinelor sirtuinei pentru a imita efectele anti-îmbătrânire ale restricției calorice, inclusiv prevenirea tulburărilor metabolice și îmbunătățirea fenotipurilor legate de vârstă. Rezultatele au arătat că AMPc poate fi combinat direct cu SIRT1/SIRT3, sugerând că AMPc are un efect anti-îmbătrânire și este un bun candidat pentru mimetice cu restricții calorice.

Rezultatul

AMPc exogen îmbunătățește fenotipul asociat cu îmbătrânirea la șoareci mai în vârstă

Tratamentul CAMP îmbunătățește metabolismul grăsimilor pentru a reduce caloriile mimice

Pentru a demonstra rolul AMPc în reducerea caloriilor, am hrănit șoarecii cu o dietă bogată în grăsimi (60% energie din grăsimi) conținând diferite doze de AMPc sau resveratrol ca un control pozitiv. Rezultatele au arătat că greutatea corporală a șoarecilor tratați cu AMPc a arătat o reducere dependentă de doză comparativ cu șoarecii netratați hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi (Fig. 2A), fără modificări semnificative ale aportului de alimente (Fig. 2B). O dietă bogată în grăsimi a dus la un declin funcțional coordonat cauzat de supraponderalitatea; Tratamentul CAMP a îmbunătățit coordonarea motorie la șoarecii cu conținut ridicat de grăsimi (Fig. 2C). Am analizat țesutul adipos epididimal al șoarecilor și am constatat că tratamentul AMPc a determinat o reducere dependentă de doză a dimensiunii țesutului adipos (Fig. 2D). Rezultatele biopsiei au arătat că o dietă bogată în grăsimi a dus la o creștere a dimensiunii adipocitelor în ficatul șoarecelui și în țesutul adipos abdominal; după tratamentul AMPc, dimensiunea adipocitelor a avut tendința la normal (Fig. 2E, F). Nivelurile trigliceridelor și ale colesterolului total au fost crescute în grupul cu conținut ridicat de grăsimi în comparație cu grupul netratat, iar grupul tratat cu AMPc a avut niveluri mai mici ale ambelor, sugerând că AMPc poate îmbunătăți tulburările metabolice (Fig. 2G, H).

AMPc propagă sirtuina pentru a preveni deteriorarea oxidativă și îmbătrânirea celulelor

Scăderea proliferării celulare și stresul oxidativ crescut sunt două cauze importante ale îmbătrânirii celulare. Pentru a examina mecanismul care stă la baza efectului anti-îmbătrânire al AMPc, am examinat modificările ciclului celular cu sau fără tratament AMPc în comparație cu Rolipram ca un control pozitiv. Rezultatele au arătat că proporția celulelor din faza S a arătat o tendință de creștere, dar nu a atins semnificația statistică, sugerând că mecanismul cAMP anti-îmbătrânire nu depinde de proliferarea crescută a celulelor (Fig. 3A).

Pentru a confirma efectul activator al AMPc asupra sirtuinei, am măsurat nivelurile intracelulare de AMPc și rezultatele diferențierii în linia celulară C2C12 (Fig. 3F, G), deoarece restricția glucozei inhibă diferențierea scheletului mioblastului prin activarea SIRT122. Rezultatele au arătat că tratamentul AMPc a inhibat diferențierea celulelor C2C12, sugerând că AMPc crește activitatea SIRT1. Pe baza rezultatelor experimentelor noastre pe animale, am speculat că efectul anti-îmbătrânire al AMPc ar putea fi atins prin reducerea stresului oxidativ, așa că am folosit peroxid de hidrogen (generat de ROS) pentru a induce îmbătrânirea celulară. Rezultatele β-galactozidazei asociate senescenței (SA-β-gal) au arătat că tratamentul AMPc poate preveni îmbătrânirea celulară indusă de ROS (Fig. 3H), sugerând că AMPc reduce stresul oxidativ. Rezultatele au arătat, de asemenea, că tratamentul cu db-cAMP și-a pierdut funcția în reducerea numărului de celule de colorare pozitive cu tratamentul EX-527 (inhibitor de sirtuină), sugerând că capacitatea stresului oxidativ al cAMP a fost dependentă de sirtuină (Figura S). Aceste rezultate sugerează că efectul antioxidant al AMPc ar trebui să depindă de creșterea activității SIRT1 și SIRT3.

cAMP leagă direct SIRT1 și SIRT3

Pentru a investiga în continuare mecanismul efectului reglator al AMPc asupra sirtuinei, am efectuat o analiză a activității sirtuinei in vitro. Rezultatele sugerează că AMPc poate crește activitatea SIRT1 și SIRT3 (Fig. 4A, B). Mai mult, tehnica rezonanței plasmonice de suprafață (SPR) a fost utilizată pentru a detecta interacțiunea dintre AMPc și sirtuină. Rezultatele au arătat că AMPc se poate lega direct de SIRT1 (KD = 1,05) și SIRT3 (KD = 4,708) in vitro (Fig. 4C-E). Deoarece atât SIRT1, cât și SIRT3 sunt lizin deacetilaze dependente de NAD + și NAD + conține o porțiune AMP, similaritatea structurală a AMPc cu NAD + a dus la o capacitate de legare similară. Analiza autotransport a fost efectuată pentru a explica mecanismul care stă la baza rezultatului legării AMPc la SIRT1, iar siturile de legare AMPc s-au dovedit a fi similare cu NAD + atunci când sunt legate la proteina SIRT1 (Fig. 4F, G). Munca noastră ar putea oferi un punct de plecare pentru studierea mecanismului de bază al efectului reglator al AMPc asupra sirtuinei (Fig. 5).

( A ) Analiza activității SIRT1. ( B ) Analiza activității SIRT3. ( C - E ) Rezonanță plasmonică de suprafață care măsoară legarea cAMP sau db-cAMP la proteinele SIRT1 sau SIRT3. Proteinele SIRT1 sau SIRT3 au fost imobilizate pe un cip senzor CM5. Testele de legare au fost efectuate folosind un interval de concentrații de AMPc sau db-AMPc (15, 6-500 μM). ( F, G ) Diagrama mecanică a interacțiunii dintre AMPc și SIRT1 obținută prin analiza docului. Primul grafic arată interacțiunea dintre NAD și SIRT1 comparativ cu al doilea grafic, care arată interacțiunea dintre cAMP și SIRT1. Toate analizele statistice au fost efectuate folosind ANOVA unidirecțional. # p ## p ### p

Imagine la dimensiune completă

discuţie

Studiul nostru arată că suplimentele dietetice AMPc pot crește reglarea nivelului de proteine ​​sirtuin, întârzând astfel apariția fenotipurilor legate de vârstă prin prevenirea tulburărilor metabolice. Am arătat că AMPc se poate lega direct atât de SIRT1 cât și de SIRT3 in vitro, crescând astfel activitățile SIRT1 și SIRT3 și mimând efectele restricției calorice. Aceste descoperiri sugerează că AMPc joacă un rol important în procesul de îmbătrânire și are un potențial promițător ca mimetic cu restricții calorice pentru prevenirea bolilor legate de îmbătrânire.

De la descoperirea AMPc ca al doilea mesager care a dus la premiul Nobel al cercetătorului în 1971, studiile s-au concentrat asupra AMPc. Cu toate acestea, până în prezent, AMPc nu a apărut ca un candidat pentru a imita restricția calorică pentru a încetini procesul de îmbătrânire. Studiile au arătat că foamea crește nivelurile de AMPc ca urmare a nivelurilor ridicate de glucagon sau a nivelurilor scăzute de insulină/IGF-1 care semnalizează 15, 23, sugerând că AMPc poate juca un rol important în restricția calorică. Cu toate acestea, înainte de studiul nostru, AMPc exogen nu a fost raportat ca un candidat pentru a imita restricția calorică. Munca noastră oferă dovezi care să susțină că restricția calorică crește nivelurile endogene de AMPc în mai multe organe pentru a îmbunătăți fenotipurile legate de îmbătrânire. Mai mult, AMPc exogen poate imita efectul anti-îmbătrânire al restricției de calorii, inclusiv reglarea în sus a SIRT1 și SIRT3, care sunt proteine ​​cheie în metabolism și îmbătrânire.

Concentrația fiziologică intracelulară a AMPc este de 0,1 - 1 μM, dar în cazul hormonilor sau al stresului, concentrația AMPc poate crește de peste o sută de ori (aproximativ 100 μM). În evaluarea activităților SIRT1 și SIRT3, am folosit 100 μM cAMP și db-cAMP pentru a imita concentrațiile în domeniul fiziologic. Deoarece doar o parte din AMPc suplimentat ar putea pătrunde stabil în celule, sugerăm că aceste concentrații pot avea un efect similar cu condițiile de stres ușor, adică restricția calorică.

Recent, s-a raportat că resveratrolul este un inhibitor al fosfodiesterazei (PDE4) care se leagă competitiv de PDE4 și inhibă degradarea AMPc 3. Am emis ipoteza că AMPc se poate lega de SIRT1, iar rezultatele SPR au dovedit ipoteza noastră și au demonstrat că AMPc și SIRT1 au o interacțiune directă in vitro. Mai interesant, cAMP are, de asemenea, o interacțiune directă cu SIRT3, care reglează producția mitocondrială de ROS și încetinește procesul de îmbătrânire. Atât SIRT1, cât și SIRT3 sunt lizin deacetilaze dependente de NAD +. NAD + conține o porțiune AMP, astfel încât AMPC interacționează direct cu familia de proteine ​​Sirtuin. Munca noastră a furnizat dovezi că AMPc ar putea fi un substrat analog al sirtuinei în condiții cu restricții calorice.

Rezultatele andocării automate au arătat că AMPc a interacționat cu buzunarul de legare NAD + SIRT1, dar nu a blocat situl catalitic. Reacția sirtuinei și NAD + a condus la hidroliza NAD + în două părți, NAM și 2'-O-acetil-ADP-riboză. Pe baza analizei structurii moleculare a AMPc și NAD +, am putut observa că atunci când AMPc legat de SIRT1, doar jumătate din punga de legare a fost ocupată și o parte catalitică a fost disponibilă pentru reacția dintre SIRT1 și NAD +. În acest caz, NAD + va interacționa cu situl catalitic, ducând la un risc mai mare de hidroliză NAD +. Am emis ipoteza că legarea AMPc la sirtuină a redus stabilitatea NAD +, ceea ce a îmbunătățit eficiența reacției dintre NAD + și sirtuină.

Am emis ipoteza că legarea AMPc și SIRT1 protejează situl catalitic care a fost buzunarul de legare al Sirtuinei și NAD +. În acest fel, AMPc ar putea crește post-transcripțional nivelul proteinei SIRT1, așa cum am discutat deja. Ipotezăm că efectul AMPc asupra creșterii nivelurilor de proteine ​​SIRT1 și SIRT3 sa bazat pe creșterea stabilității proteinelor prin legare, ceea ce ar putea limita degradarea proteinelor.

Munca noastră a arătat că AMPc este un bun candidat pentru a imita restricția calorică. Ca al doilea mesager intracelular, AMPc este important în multe procese biologice. Procesul de îmbătrânire este, de asemenea, complex și nu poate fi explicat printr-o singură cale de semnalizare. Credem că efectul anti-îmbătrânire al AMPc poate depinde de o rețea de transducție a semnalului care include mai mult de o țintă, ceea ce înseamnă că AMPC vizează cascade de semnalizare multiple în reglarea procesului de îmbătrânire.

Proceduri experimentale

Animale și diete

Șoareci BALB/c de sex masculin tineri (în vârstă de 3 luni) au fost cumpărați de la Vital River Laboratories și tratați conform instrucțiunilor și aprobării Comitetului de Etică Instituțională din China Mai multe detalii sunt date în materialul suplimentar.

Cultura și tratamentul celular

Liniile celulare C2C12 și 3T3-L1 au fost cultivate în DMEM (Thermo Scientific) suplimentat cu 10% FBS în 5% CO 2. Ex-527, compusul C, STO609 (Sigma) și H89 (Cell Signaling Technology) au fost adăugate cu 1 oră înainte de administrarea AMP ciclic, db-cAMP și Rolipram (Enzo Life Sciences). Celulele au fost apoi incubate încă o oră înainte de recoltare. Mai multe detalii sunt date în materialul suplimentar.

Teste comportamentale

Pentru fiecare grup, activitatea motorie locală și timpul scurs de la tija rotativă accelerată (Academia Chineză de Științe Medicale) au fost măsurate pentru a testa coordonarea și echilibrul motorului. Labirintul de apă Morris și latența de cădere din testele de șir au fost efectuate folosind echipamente de la Life Science Center de la Universitatea Tsinghua.

Măsurarea conținutului de carbonil 8

Carbonilii proteinelor au fost cuantificați cu 2,4-dinitrofenilhidrazină (DNPH). Pe scurt, 1 ml de 0,5 mg de proteină a fost tratat cu 200 ml de DNPH 10 mM (dizolvat în HCI 2M) timp de 1 oră și apoi a precipitat cu acid tricloracetic 10%. Peletele au fost spălate de trei ori cu 1: 1 (v/v) etanol: acetat de etil și dizolvate în 0,5 ml SDS 0,2%, 20 mM Tris-Cl, pH 6, 8. Concentrația de proteină din soluția finală a fost apoi determinată folosind un kit BCA (Thermo Scientific) și absorbanța la 360 nm a fost măsurată pentru a calcula conținutul de carbonil. Probele de proteine ​​tratate cu HCI, dar nu cu DNPH au fost utilizate ca semifabricate.

Măsurarea nucleotidelor

Măsurarea AMPc a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului utilizând un kit de testare Glo-AMPc (Promega). Mai multe detalii sunt date în materialul suplimentar.

Măsurători biochimice

Măsurarea colesterolului total, a trigliceridelor și a MDA a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului folosind un kit de cuantificare (Blue Gene). Colorarea SA-ß-gal a fost efectuată conform instrucțiunilor producătorului (Sigma).

Observarea secțiunilor histochimice

Secțiuni de ficat și țesut adipos au fost colorate cu hematoxilină și eozină; colagenul pielii a fost colorat cu tricromul lui Masson. Observațiile au fost efectuate cu ajutorul unui microscop cu lumină (Leica) și scanate la o mărire de 40x.

Analiza proteinelor

Probele pentru Western blot au fost prelevate pe geluri SDS-poliacrilamidă 10% și transferate în membranele PVDF. Au fost utilizați următorii anticorpi: SIRT1, SIRT3 NF-κB și PPARγ (Cell Signaling Technology) și CaMKKII, PKAc, SIRT6 (Abgent) și PEPCK și Actin (Santa Cruz).

Rezonanță plasmatică de suprafață

Proteinele SIRT1 (Abcam, puritate = 95%) sau SIRT3 (R&D, puritate = 95%) purificate au fost imobilizate pe un cip senzor CM5 (T200 Biacore, GE). Rezultatele sortării și imobilizării pH-ului sunt date în informațiile suplimentare (Figura S3-4).

Analize statistice

Comparațiile între grupuri au fost efectuate de ANOVA unidirecțional. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la p