hematopoietice

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Postul induce migrarea celulelor hematopoietice în PVN
  • Caracteristicile celulelor hematopoietice din PVN
  • Microglia care exprimă BDNF sunt în contact cu neuronii PVN
  • Șoarecii cu o deleție BDNF specifică BM sunt hiperfagi și obezi
  • BMT salvează anomaliile metabolice ale deficitului de BDNF
  • discuţie
  • metode
  • Studii pe animale și in vivo
  • Imunohistochimie și microscopie imunoelectronică
  • Microdisecție cu captare laser și izolarea ARN-ului
  • RT cantitativ - PCR
  • Microarray de ADN
  • Sonde de hidroliză în RT - PCR pentru variantele BDNF
  • Injecția intracerebroventriculară a celulelor mononucleare
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Celulele stem hematopoietice
  • hipotalamus
  • Factori neurotropi
  • Obezitatea

abstract

Factorul neurotrofic cerebral (BDNF) suprimă consumul de alimente acționând asupra neuronilor din hipotalamus. Aici, arătăm că celulele hematopoietice producătoare de BDNF reglează apetitul și echilibrul energetic prin migrarea către nucleul hipotalamic paraventricular. Aceste celule nuclee paraventriculare hematopoietice produc markeri microgliali și fac contacte directe cu neuronii ca răspuns la aportul de alimente. Șoarecii cu deficit congenital de BDNF, în special celulele hematopoietice, dezvoltă hiperfagie, obezitate și rezistență la insulină. Aceste anomalii sunt atenuate prin transplantul de măduvă osoasă cu celule de măduvă osoasă de tip sălbatic. Mai mult, atunci când sunt injectate în cel de-al treilea ventricul, celulele mononucleare de măduvă osoasă de tip sălbatic rămân acasă pentru nucleul paraventricular și inversează hiperfagia șoarecilor cu deficit de BDNF. Rezultatele noastre sugerează un nou mecanism de control nutrițional bazat pe producția de BDNF în celulele hematopoietice și indică potențiale noi tratamente terapeutice pentru obezitate.

Factorul neurotrofic al creierului (BDNF), membru al familiei neurotrofinei, este exprimat pe scară largă în creier, incluzând nucleele hipotalamice cheie cunoscute a fi importante pentru reglarea echilibrului energetic 1 și a țesuturilor periferice, inclusiv a mușchilor, ficatului, țesutului adipos și a celulelor hematopoietice . 2, 3, 4. Pe lângă rolul său în acțiunea neurotrofică, BDNF este un regulator central al homeostaziei energetice. Infuzia intracerebroventriculară de BDNF la rozătoare reduce hrănirea și greutatea corporală 5, 6. În schimb, șoarecii care nu au o copie a genei Bdnf dezvoltă hiperfagie și obezitate 7, 8. La om, haploinfectivitatea genetică a BDNF 9, mutațiile genei care codifică receptorul său TrkB (NTRK2) 10 și studiile de asociere 11, 12 implică colectiv BDNF în reglarea aportului de alimente și dezvoltarea obezității.

Pentru a identifica originea producției de BDNF pentru reglarea echilibrului energetic, studiile anterioare s-au concentrat fie asupra neuronilor creierului întreg, fie asupra nucleilor specifici din hipotalamus 13. Având în vedere descoperirile recente că celulele hematopoietice găzduiesc țesuturile creierului și că celulele hematopoietice exprimă BDNF bogat 2, 3, 4, am investigat dacă BDNF produs de celulele hematopoietice, care sunt acasă la țesuturile creierului, este implicat în reglarea echilibrului energetic și a apetitului .

Rezultatul

Postul induce migrarea celulelor hematopoietice în PVN

Șoarecii C57BL/6 de opt săptămâni au primit iradiere a întregului corp (9 Gy) și transplant de măduvă osoasă (BMT) (BMT) de la șoareci C57BL/6 transfectați cu proteină fluorescentă verde (GFP) 14. Opt săptămâni mai târziu, am numărat numărul de celule derivate din GFP în diferite nuclee ale hipotalamusului în diferite condiții de hrănire (Fig. La-c). Am constatat că celulele hematopoietice derivate din BM erau legate de hipotalamus, în special în nucleul paraventricular (PVN), centrul de saturație pentru mâncare și băut. Interesant este că foamea (16 sau 24 de ore) a dus la un număr semnificativ crescut de celule GFP + în PVN (Fig. 1b); numărul a revenit la valoarea inițială în decurs de 4 ore după administrarea repetată după un post de 16 ore (Fig. 1c). Densitatea celulară GFP + nu s-a modificat semnificativ în alte nuclee hipotalamice examinate (Fig. 1d).

40% din celulele GFP + au produs factor de creștere transformant-β (Figura suplimentară S1b), un factor derivat din microglie care promovează supraviețuirea neuronală 17 .

Caracteristicile celulelor hematopoietice din PVN

Șoarecii cu o deleție BDNF specifică BM sunt hiperfagi și obezi

A ) Schema unei strategii pentru a genera o ștergere congenitală a BDNF specific BMDC (BM-BDNF -/-) prin încrucișarea genotipurilor Bdnf tm3Jae/J și B6.129P2-Lyzs tm1 (cre) Ifo/J. Grundele 1 și 2 au fost concepute pentru a detecta ADN genomic. Grundele 3 și 4 au fost concepute pentru a detecta ARNm. ( b ) Imunomarcare pentru BDNF și Iba1 la PVN BM-BDNF -/- și șoareci de control LysM-cre (BM-BDNF +/+). Săgeata indică co-localizarea colorării pentru BDNF și Iba1 în celulele BM-BDNF +/+ și săgeata indică absența unei astfel de co-localizări în celulele BM-BDNF -/-. Scală, 10 μm. ( c ) Analiza de co-localizare a colorării BDNF și expresia GFP în celulele GFP-TG/BM-BDNF -/-. Șoarecii GFP-TG/BM-BDNF -/- au fost creați prin încrucișarea șoarecilor GFP-TG și BM-BDNF -/-. BDNF nu a fost co-localizat cu GFP în celulele GFP-TG/BM-BDNF -/-. Scală, 10 μm. d ) Analiza genomică a BM-BDNF -/-. Gena BDNF de 1,3 kb este ștearsă în celulele mononucleare și celulele GFP-pozitive obținute de la șoareci PVN GFP-TG/BM-BDNF -/- de LCM. ( e ) Expresie mARN de BDNF. ARNm BDNF nu a fost exprimat în celule GFP-pozitive obținute de la șoareci PVN GFP-TG/BM-BDNF -/- de LCM.

Imagine la dimensiune completă

( A - c ) Comparația greutății corporale ( A ), consumul de alimente b ) și aportul de apă ( c ) la BM-BDNF -/- și controlează șoarecii Cre (BM-BDNF +/+) (n = 10). Superior: masculin, inferior: feminin. d ) Compararea nivelurilor de glucoză și insulină și ASC corespunzătoare în GTT intraperitoneal la BM-BDNF -/și șoareci de control Cre (n = 8-11). GTT, test de toleranță la glucoză; ASC, zona de sub curbă. e ) Consumul de O 2 de BM-BDNF -/- comparativ cu șoarecii de control Cre în perioadele de lumină și întuneric (n = 12). Toate datele reprezintă media ± sd * P

( a - c ) Greutate corporala ( A ), consumul de alimente b ) și aportul de apă ( c ) la BM-BDNF -/- șoareci care primesc BMT de la BM-BDNF +/+ sau BM-BDNF -/- șoareci (n = 10)). Grafice superioare: masculin, inferior: feminin. d ) Nivelurile de glucoză și insulină și aria corespunzătoare sub curbă (ASC) la 5 luni după BMT în aceleași grupuri ca în (n = 5-6) în GTT. e ) consum 2 6 luni după BMT în aceleași grupuri experimentale ca în A (n = 9). Modificări ale consumului de alimente ( f ) si apa ( g ) după injectarea intracerebroventriculară a celulelor mononucleare (n = 4-6). Date: în medie la 7 zile după injectarea celulelor. ( h ) Analiza microscopică a celulelor GFP pozitive injectate în PVN. Panoul din stânga: BM-MNC izolate de șoareci GFP-Tg/BDNF +/+ au fost injectate în cel de-al treilea ventricul (3V) de șoareci BM-BDNF -/-. Panoul din dreapta: s-au injectat BM-MNC izolate din șoareci GFP-Tg/BDNF -/-. Săgeată: celule GFP-pozitive. Scală, 50 μm. Toate datele reprezintă media ± sd * P + P = 0,06, + P = 0,08.

Imagine la dimensiune completă

Deoarece monocitele și macrofagele sunt prezente în mai multe organe 27, ștergerea genei BDNF ca răspuns la activitatea Cre condusă de promotorul LysM nu trebuie să fie limitată la celulele microgliene ale creierului. Prin urmare, am comparat efectele injectării de soluție salină sau BM-MNC izolate din șoareci GFP-TG/BDNF +/+ sau GFP-TG/BM-BDNF -/- în cel de-al treilea ventricul al șoarecilor BM-BDNF -/-. Într-o perioadă relativ scurtă de 8 zile după injecția intracerebrovasculară, timp în care a existat o reducere semnificativă a aportului de alimente (Fig. 5f) și a consumului de apă (Fig. 5g) la receptorii BMT ai celulelor hematopoietice GFP-TG/BDNF +/+, celulele GFP + BM derivate de donator au fost detectabile la șoarecii primitori de PVN (Fig. 5h).

discuţie

Mai multe linii de dovezi prezentate în acest studiu sugerează că BDNF derivat din celule hematopoietice pare a fi la fel de important ca BDNF derivat din neuroni în controlul apetitului și obezității la animalele adulte. Ca răspuns la celulele hematopoietice rapide de 16 ore care găzduiesc PVN, unde dobândesc multe caracteristici microglia și vin în contact cu neuronii locali. Prin producerea unei variante hematopoietice specifice a BDNF, aceste celule derivate din BM reglează aportul alimentar prin PVN.

Este important de reținut că inducerea indusă de post a celulelor derivate din BM la PVN apare la șoareci iradiați în întregul corp în absența sau prezența unui scut pentru cap. Iradierea SNC în sine poate deteriora vasculatura din creier și permite intrarea anormală a precursorilor microgliali din circulația în SNC 15, 16. Cu toate acestea, am arătat că în condițiile noastre experimentale a existat doar o creștere ușoară și nesemnificativă (

17%) din numărul de celule derivate din BM care au migrat către PVN la șoareci fără cap, comparativ cu celulele cu ecran frontal. Mai mult decât atât, o rapidă de 16 ore a indus o creștere comparabilă a numărului de celule hematopoietice care induc PVN la șoareci protejați de cap comparativ cu șoareci iradiați neprotejați.

Natura semnalului care stimulează migrarea celulelor hematopoietice către PVN necesită investigații suplimentare. Interesant, analiza microarray a relevat că mARN pentru Cxcl2, o chemokină produsă de celulele endoteliale și nervoase, a fost> de 30 de ori mai mare în PVN în repaus comparativ cu șoarecii hrăniți (tabelul suplimentar S2). Chimiochinele și citokinele sunt implicate în introducerea microgliei sau celulelor derivate din BM în sistemul nervos, în special ca răspuns la leziuni sau ischemii din creier 17 sau leziuni ale măduvei spinării 29. Cxcl2 prezintă o activitate chimiotactică puternică împotriva comerțului cu celule BM/hematopoietice. Expresia sa crescută în PVN la aceste animale ar putea declanșa rapid migrarea celulelor derivate din BM către PVN timp de 16 ore.

Acesta este raportul inițial al înfometării celulelor hematopoietice induse de înfometare pe PVN, nucleul hipotalamic, unde BDNF produs de aceste celule poate regla negativ apetitul. Eficacitatea in vivo a BDNF derivat din BM este evidentă la șoarecii BM-BDNF -/-, a căror incapacitate de a răspunde la supraproducția de BDNF în post în PVN se manifestă sub formă de polidipsie, hiperfagie și obezitate. Alte laboratoare au raportat că induce foamete

Reducerea cu 50% a nivelurilor de BDNF-mARN la șoareci VMH 5, 30, 31, reacție care se așteaptă să ducă la creșterea poftei de mâncare. Important, după un post de 16 ore, nu am găsit nicio modificare în BDNF în VMH. În concordanță cu această observație, alții au descoperit că transcrierile BDNF nu scad în VMH până la 48 de ore rapid. Controlul apetitului implică o rețea cuprinzătoare de noduri de reglementare care acoperă diferitele organe ale tractului gastro-intestinal în diferite zone ale creierului 32. Recrutarea relativ acută a celulelor hematopoietice producătoare de BDNF către PVN poate fi un răspuns homoeostatic la stresul de post. Deși este probabil ca o creștere timpurie a BDNF în PVN (prin legarea celulelor hematopoietice) poate deschide calea pentru reglarea întârziată a BDNF în VMH, relația exactă dintre cele două procese necesită o investigație suplimentară. În acest studiu, am examinat în principal neuronii CRH. Cu toate acestea, în PVN, alți neurohormoni, cum ar fi hormonul care eliberează tirotropina, oxitocina și nesphatina, pot fi implicați în controlul hrănirii și metabolismului și merită investigații suplimentare în viitor.

Rolul esențial al expresiei hematopoietice a BDNF în controlul apetitului este puternic susținut de o serie de experimente care implică șoareci care și-au pierdut capacitatea de a produce BDNF (și șoareci care refac această capacitate) exclusiv în celule derivate din BM. Recent, s-a descoperit că celulele hematopoietice derivate din BM migrează către hipocamp după stresul indus de șocurile de la picioare la șoareci 14. Astfel, s-a demonstrat că diferite tipuri de stimuli migrează celulele derivate din BM în regiuni specifice ale SNC. Se știe de zeci de ani că celulele hematopoietice mononucleare produc BDNF, deși funcția posibilă a celulelor periferice care produc o moleculă bioactivă atât de puternică a fost evazivă. Acum, că recunoaștem că celulele hematopoietice au acces la regiuni specifice ale SNC ca răspuns la diferiți stimuli, sperăm că descoperirile prezentate aici vor încuraja descoperirea altor funcții ale SNC care sunt potențial reglementate de produsele genetice produse de celulele hematopoietice. În cele din urmă, descoperirea implicării celulelor hematopoietice ușor disponibile în controlul apetitului a oferit o nouă perspectivă asupra patogenezei, în timp ce poate accelera dezvoltarea de noi terapii pentru obezitate, precum și a sindroamelor de dereglare a apetitului, cum ar fi anorexia nervoasă. și bulimie.

metode

Studii pe animale și in vivo

Imunohistochimie și microscopie imunoelectronică

Microdisecție cu captare laser și izolarea ARN-ului

Probele de țesut din secțiuni înghețate cu grosimea de 12 μm pentru analiza ARN au fost obținute din fiecare nucleu hipotalamic sau din 50 de celule GFP pozitive sau negative capturate pe un singur CapSure HS LCM Cap (Arcturus Engineering, Mountain View, CA) utilizând următorii parametri: dimensiunea spotului = 7,5 μm; putere = 50-80 mW; iar durata pulsului = 50-1.000 μs. ARN-urile totale au fost izolate prin trusa de izolare a ARN-ului PicoPure (Arcturs) și tratate cu DNază I (Invitrogen).

RT cantitativ - PCR

Am efectuat RT - PCR cantitativ cu LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit și LightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics). Fluorescența emisă pentru fiecare reacție a fost măsurată de trei ori în timpul fazei de recoacere/extensie, iar graficele de amplificare au fost analizate prin utilizarea LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Contaminarea potențială a ADN-ului genomic a fost controlată prin utilizarea unor primeri care cuprind introni și digestie cu DNază. Valoarea relativă din fiecare probă a fost calculată prin curba standard obținută din probele martor și standardizată ca coeficient împărțit la valoarea obținută simultan pentru gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) în același experiment. ADNc din prima catenă a fost utilizat în analizele PCR ulterioare. Au fost utilizați următorii primeri: BDNF; Grund 5 ′ amonte, 5′-TTGTTTTGTGCCGTTTACCA-3 ′ și grund amonte 3 ′, 5′-GGTAAGAGAGCCAGCCACTG-3 ′, GAPDH; 5 'grund în amonte, 5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3' și 3 'grund în aval, 5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'. Identitatea produselor PCR a fost confirmată prin mărime după electroforeza pe gel de agaroză și analiza secvenței de nucleotide. Semnalul care rezultă din ARNm GAPDH a servit drept control intern pentru a evalua diferențele dintre diferite probe.

Microarray de ADN

Am capturat celule GFP-pozitive de la cinci șoareci GFP-BMT diferiți sau PVN întreg de la cinci șoareci de tip sălbatic, atât în ​​hrănire cât și în post (16 ore) prin LCM. Probele au fost trimise la Bio Matrix Research Laboratory (Japonia), unde probele de ARN au fost verificate de Agilent 2100 BioAnalyser (Agilent Technologies) și NanoDrop (NanoDrop Technologies). Probele de ARN au fost amplificate prin marcarea țintei în două cicluri, transformate în ADNc biotinilat și hibridizate la matricea GeneChip U34A de genomul mouse-ului Affymetrix (Santa Clara, CA). Am folosit Gene Spring Viewer (Agilent Technologies) pentru a analiza datele și am calculat raportul de expresie (r = post/hrănit). Am arătat expresia genelor legate de microglie (LCM a celulelor GFP-pozitive) și a citokinelor și a genelor legate de inflamație (LCM a PVN întreg) cu rezultatul r> 2 și r 21 (Tabelul suplimentar S4). Amplificarea a fost efectuată cu teste PCR în timp real folosind sonde 5'FAM (Sigma Genosys) pe LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics). Volumul final de reacție de 20 μl a inclus 5 μl de ADNc, 0,5 μM din fiecare primer (primer direct și primer invers), 0,1 μM de sondă 5 ′ FAM și 10 μl LightCycler 480 Probes Master (Roche Diagnostics).

Injecția intracerebroventriculară a celulelor mononucleare

Am izolat fracția de celule mononucleare de la BM de șoarece folosind Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare). După ce a fost anesteziat, capul șoarecilor a fost fixat folosind instrumente stereotaxice (SR-6, Scientific Instrument Lab., Tokyo, Japonia). Celulele au fost injectate în al treilea ventricul folosind un ac de 30-G atașat la o seringă Hamilton în conformitate cu coordonatele obținute din manual de Paxinos și Watson 34 (-0,82 mm de la bregma). Volumul injectat al suspensiei de celule a fost de 5 μl și numărul de celule pe șoarece a fost 1 × 106 .

analize statistice

Rezultatele sunt prezentate ca mijloace ± sd Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul SPSS Statistics 19. Testul t Student a fost folosit pentru a compara două grupuri independente, iar analiza unică a varianței sau analiza repetată a varianței măsurată, urmată de testul de comparație multiplă, a fost utilizată pentru a compara trei sau mai multe grupuri. O diferență semnificativă statistic a fost definită ca valoare P