obiecte

abstract

inferioare

Cartografierea geografică a speciilor Decalepis în India. Hărțile au fost generate folosind instrumente în Google Earth Versiunea 7.1.7.2606 (http://www.neowin.net/news/google-earth-pro-7172606) pe baza coordonatelor GPS înregistrate (Garmin) la punctele de colectare.

Imagine la dimensiune completă

În studiul nostru recent pentru a evalua diversitatea genetică și structura populației în populațiile sălbatice de D. arayalpathra pe baza studiilor demografice și a datelor genetice din testele marker, am demonstrat apariția diversității genetice scăzute și a diferențierii genetice ridicate între populații 16. În plus, sa constatat că populațiile au o distribuție limitată și o fragmentare ridicată și s-au dovedit a fi supraexploatate de recoltarea distructivă. Specificitatea largă, deteriorarea viespii fructelor, starea restrânsă a populației, fluxul genetic limitat și putrezirea rădăcinilor fungice sunt toți factorii care au amenințat acest grup în habitatul lor natural 16, 17. Acest lucru semnalează necesitatea recunoașterii taxonilor în punctele fierbinți de biodiversitate, care este un factor cheie în aplicarea reglementărilor de protecție a plantelor și a viitoarei protecții a speciilor 18 .

Mulți cercetători au evaluat până acum combinația mai multor regiuni plastide și nucleare propuse pentru a-și desfășura cercetările cuprinzătoare în grupuri complexe taxonomic de 24, 25, 27, 29, 34, 35, 36. Cercetarea codului de bare se deplasează în prezent dincolo de această fază a evaluării. În plus față de o aplicație practică care oferă cunoștințe de taxonomie la nivel de specie, această tehnologie este recunoscută ca un instrument eficient prin furnizarea unei puteri discriminatorii provocatoare pentru speciile comerciale (listate CITES), identificarea criminalistică și analiza criminalistică ecologică, precum și identificarea speciilor pentru specii rare. grupuri de plante pe cale de dispariție și pe cale de dispariție 37, 38, 39. Potențialul codurilor de bare ADN de a identifica o specie chiar și dintr-o cantitate mică de țesut (în loc de întreaga plantă, de preferință în stadiul de înflorire, așa cum este cerut de metodele taxonomice actuale) extinde setul de instrumente taxonomice prin abordarea comerțului ilegal cu specii pe cale de dispariție.

În absența unui consens uniform al codului de bare universal al plantelor, este necesar să se determine regiunea (regiunile) optimă (e) în funcție de taxonii de interes. Găsirea codului de bare potrivit pentru genul Decalepis lipsește complet. Prin urmare, acest studiu a fost conceput pentru a crea prima bibliotecă de referință care folosește cele mai eficiente coduri de bare pentru a oferi identitate moleculară speciilor Decalepis pe cale de dispariție și endemice. Eficacitatea diferitelor abordări analitice ale datelor de codare a barei ADN va fi evaluată pentru a testa rezoluția markerilor selectați pentru Decalepis. Constatările acestui studiu, confirmate de dinamica populației propuse în cercetarea noastră recent publicată 16, vor oferi instrumentele valoroase necesare pentru a stabili un protocol standard pentru catalogarea identității speciilor în aplicarea CITES și pentru a elabora planuri de conservare pentru gestionarea speciilor pe cale de dispariție. acest grup.

Rezultatul

Amplificarea PCR și succesiunea succesiunii

Tabel în dimensiune completă

Tabel în dimensiune completă

Analiză la distanță și zone cu coduri de bare pentru identificarea speciilor

Grafic de coduri de bare pentru cinci coduri de bare individuale. Distanțele până la cel mai apropiat vecin (NN) față de distanțele intra-specifice maxime (%) realizate de Kimura-2 (K2P) au fost reprezentate pentru discriminarea speciilor. Fiecare punct reprezintă unul sau mai mulți indivizi deoarece au aceleași valori ale distanțelor intra-specifice și inter-specifice. Punctele de deasupra liniei 1: 1 indicau prezența unui cod de bare.

Imagine la dimensiune completă

Evaluarea golurilor codurilor de bare pentru combinații favorabile de coduri de bare Decalepis. Distanțele până la cel mai apropiat vecin (NN) au fost reprezentate grafic față de distanțele maxime intra-specifice ale parametrului Kimura-2 (K2P) (%). Fiecare punct reprezintă unul sau mai mulți indivizi deoarece au aceleași valori ale distanțelor intra-specifice și inter-specifice. Punctele de deasupra liniei 1: 1 indicau prezența unui cod de bare.

Imagine la dimensiune completă

Analiza filogenetică a speciilor Decalepis pe baza metodei parsimon

Pentru a estima diferențele evolutive dintre speciile Decalepis, am folosit metode la distanță (NJ) și caracter (MP) în toate zonele codurilor de bare. Rezultatele abordării bazate pe criterii au depășit metoda NJ pe baza distanței în alocarea caracterelor de arbore individuale. Deoarece caracteristicile sunt reduse în metodele NJ la distanțe care uneori se pierd în comparații perechi și duc la distanțe înclinate, au fost efectuate analize suplimentare folosind modelul MP ​​în PAUP.

Arborele de consens strict care arată relația speciilor Decalepis rezultate din analiza parsimoniului maxim utilizând codul de bare rbcL + matK + ITS. Lungimea arborelui = 146, CI = 85%, Ri = 91, RC = 78%. Valorile de asistență ale sistemului de pornire sub 60% nu sunt afișate. Indivizi care corespund speciilor de monofile: roșu: D. arayalpathra, verde: D. salicifolia, albastru: D. hamiltonii .

Imagine la dimensiune completă

Compararea metodelor discriminante și a zonelor codurilor de bare

Tabel în dimensiune completă

Pe baza unei comparații a metodelor, atât abordările TaxonDNA, cât și cele BLOG s-au comportat la fel de bine în medie în toate codurile de bare favorabile (ambele au furnizat 75-100% identificare corectă). Cu toate acestea, rata de identificare greșită a tuturor locurilor a fost de 0% în TaxonDNA, dar de 25% în BLOG (Tabelul 3, evidențiat în gri). În schimb, BLOG-ul a depășit TaxonDNA de către 0% dintre persoanele rezultate ca „neidentificate”, în timp ce

11, 76% dintre indivizi nu au fost identificați în TaxonDNA. Analiza filogenetică a speciilor Decalepis bazată pe o abordare bazată pe caracter a dus, de asemenea, la atribuirea trăsăturilor individuale ale copacilor. Astfel, metodele bazate pe caracter mai degrabă decât distanțele sunt o alegere potrivită pentru testarea ipotezelor.

discuţie

Eficacitatea regiunilor codului de bare în elucidarea identității moleculare a speciilor Decalepis

Acest studiu este prima încercare publicată de a descrie filogenia moleculară a speciilor Decalepis pe cale de dispariție și pe cale de dispariție. Arată că markerii codați cu bare pot distinge cu precizie între specii, dezvăluind îmbrăcăminte omogene de înaltă rezoluție la nivel de specie (Fig. 4). Dintre locurile plastidice și nucleare testate, STI a avut cea mai mare eficacitate ca singurul locus în identificarea speciilor din Decalepis (Fig. S3). Numărul mare de copii ale genelor ARNr, o putere discriminantă mai mare la niveluri taxonomice scăzute și o rată evolutivă mai mare fac din STI un loc promițător în sistemul molecular al plantelor 40. Semnalizarea filogenetică îmbunătățită a STI în comparație cu markerii de coduri de bare plastide din Decalepis este compatibilă cu rezultatele altor studii la nivel de gen în Passiflora 41, Euphorbia 42, Paeonia 43 și Melilotus 44, printre altele.

Atât codurile de bare rbcL, cât și cele psbA-trnH au avut cea mai mică putere discriminantă ca singurul locus care le limitează utilitatea în Decalepis, în ciuda valorii lor pentru codurile de bare ale altor grupuri de plante 20, 24. Ambele zone nu au putut distinge între specii, iar arborele filogenetic rezultat a arătat un imens amestec excesiv de indivizi cu un sprijin slab al cladei. Înlocuirea potențială, H. indicus, grupată cu D. hamiltonii și D. salicifolia s-a dovedit a fi nerezolvată pe baza arborelui (Fig. S3). Probleme de ambiguitate și inversiuni frecvente asociate cu secvențe palindromice în regiunea psbA-trnH au fost găsite în mai multe linii de angiosperme și, eventual, complică utilizarea acestuia ca cod de bare, mai ales dacă apar în cadrul speciilor 29. Adecvarea regiunii cloroplastului rbcL pentru studii de evoluție moleculară la nivel de specie a fost controversată, în parte datorită lungimii sale

1430 bp. Pentru o discriminare clară a speciilor, este necesară secvențierea întregii regiuni, ceea ce limitează utilizarea acesteia ca o secvență de coduri de bare. Regiunea ideală de codare a barei trebuie să fie suficient de scurtă pentru a se amplifica și a fi analizată prin secvențierea cu o singură trecere 35. Cu toate acestea, adăugarea altor markeri de codare a barei în zonă le îmbunătățește capacitatea de a distinge, așa cum se arată în studiile anterioare 29, 31, 35, 45 .

Regiunea de codare a cloroplastului matK a reprezentat coduri de candidat mai bune decât codul de bare candidat, prezentând atât recuperarea secvenței ridicate, cât și un grad ridicat de identificare fie ca un singur locus, fie în combinație cu ITS. Combinația matK + ITS a încadrat întreaga specie sură de Decalepis ca grup principal, cu H. indicus situat ca grup exterior în ramura nodală de la baza copacului (Fig. 4). Gena cloroplast mama a arătat o rată mai mare de substituții de nucleotide decât alte loci testate din genomul plastidelor, care au furnizat valori inter-specifice mai mari ale divergenței între secvențele matK. Combinația nucleară a celor două coduri de bare locus ITS + ITS2 a arătat, de asemenea, un rezultat foarte similar, confirmând avantajul abordării consensului multiclocal cu coduri de bare în codarea în bare ADN a plantelor.

Fezabilitatea metodelor analitice pentru a asigura o discriminare clară împotriva speciilor Decalepis

$ config [ads_text16] nu a fost găsit

Dintre cele trei module diferite („BM”, „BCM” și „Toate tipurile de coduri de bare”) implementate în TaxonDNA, codul de bare combinat rbcL + matK + ITS a identificat corect 15 specii

Aplicarea instrumentelor pentru coduri de bare în protecția Decalepis

concluzie

Acest studiu demonstrează în mod clar eficiența codificării ADN pentru identificarea speciilor endemice. Secvențele de semnătură ale codului de bare rbcL + matK + ITS propus au furnizat semnale precise pentru a facilita identitatea moleculară a speciilor Decalepis în concordanță cu cea mai recentă revizuire taxonomică a acesteia. Regiunea a încadrat în mod clar întregul set de specii surori de Decalepis ca grup principal, cu înlocuirea potențială a H. indicus în grupul exterior situat ca o ramură nodală la baza copacului. Abordarea caracterului prin PAUP și BLOG a distins cu succes 100% din probele examinate, făcând din acuratețea și fiabilitatea lor metoda aleasă în studiile de codare a barei ADN. Testele specifice speciilor derivate din secvențele regiunii de codificare ale regiunii de codare matK confirmă în continuare valoarea acesteia în furnizarea unei metode precise de discriminare a speciilor. Se așteaptă ca includerea diferitelor populații specifice să obțină o perspectivă asupra stării de conservare a speciilor hotspot Decalepis, precum și să sublinieze aplicarea practică a codificării ADN a barei ca instrument pentru păstrarea biodiversității grupurilor de plante endemice și pe cale de dispariție.

Materiale și metode

Eșantionarea taxonului și declarația etică

Din diferite zone geografice din Tamil Nadu, Kerala și Karnataka, au fost colectați 15 indivizi aparținând a trei specii diferite de Decalepis. Două persoane din H. indicus au fost colectate din Tamil Nadu și Karnataka (Fig. 1). Probele au fost uscate pe silicagel și depozitate la -20 ° C înainte de extracția ADN-ului. Probele de voucher pentru fiecare specie luate în acest studiu au fost depozitate într-un ierbar la Fundația pentru Revitalizarea Tradițiilor Locale de Sănătate (FRLHT), Bangalore, India și CSIR-Central Institute. Plante medicinale și aromatice (CIMAP), Lucknow, India. referința și detaliile corespunzătoare sunt date în Tabelul 2.

Metode moleculare

ADN-ul total al genomului a fost izolat din probele de referință folosind protocolul 57 de bromură de cetiltrimetilamoniu (CTAB) 57. ADN-ul izolat a fost testat pentru calitate și cantitate prin electroforeză pe gel de agaroză 0,8% și analiză spectrofotometrică (NanoDrop, ND-1000, SUA). ADN-ul a fost diluat până la o concentrație finală

25 - 50 ng/ul pentru amplificarea PCR. Cinci loci ai codului de bare ADN candidați au fost amplificați cu primeri stabiliți care includeau cei doi loci codificatori ADNc, rbcL și matK; un distanțier locus intergenic necodificator cpDNA, psbA-trnH și ADN, locuri ITS și ITS2. Detalii despre primeri și condițiile PCR sunt date în Tabelul SI. Amplificările PCR pentru fiecare set de grund au fost efectuate într-un volum de 50 μl conținând 1X tampon Taq ADN polimerază, 200 μM fiecare dNTP (dATP: dTTP: dCTP: dGTP în porțiuni 1: 1: 1: 1), fiecare 5-10 pmol. primer (înainte și înapoi), 1 unitate de ADN polimerază Taq a

25-50 ng de ADN șablon. Ampliconii de succes au fost analizați prin electroforeză pe gel de agaroză 2%. Ulterior, produsele cu greutate moleculară țintă au fost purificate cu un kit de purificare Nucleospin PCR, utilizând protocolul producătorului (MACHEREY-NAGEL - 07/2014, Rev.03) și verificate din nou prin electroforeză pe gel de agaroză 2%. Produsul obținut a fost supus reacțiilor de secvențiere dioxi Sanger, în direcții înainte și inversă folosind BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) pe un analizor genetic ABI 3130 XL (Applied Biosystems).

Bazarea de date

Datele specimen pentru fiecare regiune au fost depuse în Codul de bare al sistemelor de date de viață (BOLD) 58 (//www.boldsystems.org) în cadrul proiectului CRCB - „Cod de bare ADN în Decalepis” (Tabelul 2). Toate datele sunt accesibile pe BOLD sub setul de date DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB). Secvențele au fost trimise către GenBank și sunt accesibile publicului sub numerele de aderare enumerate în tabelul 2.

Analiza datelor

Electroferogramele obținute pentru fiecare zonă au fost denumite în principal utilizând PHRED; secvențe asamblate și modificate folosind un Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI, SUA). În cele din urmă, secvențele au fost explozate la NCBI BLAST în cadrul programului BLASTN 2.2.1+ 59, 60 și ulterior la BOLD utilizând o cerere de identificare pentru a verifica omologia lor cu alte secvențe disponibile. Toate secvențele de coduri de bare au avut o lungime mai mare de 500 bp și fără contaminare. Secvențele modificate au fost apoi aliniate cu mușchiul 3.8.31 de pe site-ul EMBLEBI (//www.ebi.ac.uk) sub parametrii impliciți și modificate manual în BioEdit v7.1.3.0 61. Secvențele au fost trunchiate la ambele capete pentru a elimina secvențele primer. Toate variabilele site-ului au fost verificate din nou folosind fișierele de urmărire originale. Reconcilierea poate fi obținută de la autorul corespunzător la cerere motivată. Cinci loci candidați ai codului de bare ADN și cele 26 de combinații posibile ale acestora, împreună cu o abordare cu coduri de bare în trepte, cu mai multe gene, au fost evaluați pe baza metodelor descrise mai sus.

Analiza decalajelor bazată pe coduri de bare

Acces la caractere prin BLOG

Codarea cu bare cu LOGic (BLOG) este o abordare de învățare automată a caracterelor cu BLOG2.0 pentru a clasifica secvențele eșantionului în specii, utilizând un set de reguli de clasificare pentru localizarea codurilor de bare cheie ADN pentru nucleotidele de diagnostic 66, 67. Acesta formulează reguli de clasificare pe baza setului furnizat de date de antrenament și apoi se aplică aceleași seturi de antrenament și set de testare pentru a estima succesul identificării. Diferitele seturi de date de coduri de bare utilizate în acest studiu au fost supuse la feliere de 90% la nivel de specie cu maximum 500 de iterații (GRASPITER = 500) și un timp maxim de 5 minute pentru analiză (GRASPSECS = 300). Ca bază de identificare a fost luată formula logică cu cea mai mică rată de fals pozitiv în comparație cu setul de date de referință.

Arborii filogenetici folosind metode bazate pe distanță și caracter

Pentru a defini specia în clade discrete sau grupuri monofiletice, s-a efectuat o analiză filogenetică pe seturile de date studiate. Procesul de dezvoltare a datelor secvenței a fost evaluat pe baza metodelor bazate pe distanță și caracter. Cuplarea adiacentă la un algoritm de grupare de evoluție minimă (NJ) a fost utilizată pentru a calcula distanța evolutivă între secvențe. Arborii NJ au fost construiți în PAUP 4.0 68 pe baza distanțelor K2P ca măsurare genetică și stabilirea lungimilor negative ale ramurilor la zero.

Dintre abordările bazate pe caractere, metoda parsimone maximă (MP) a fost utilizată pentru a determina istoricul cel mai probabil al evenimentelor evolutive dintre secvențe. Analiza MP a fost efectuată în PAUP 4.0 cu modelul de substituție HKY-gamma pentru a explica schimbarea vitezei între site-uri. O căutare euristică inițială a fost efectuată cu 1000 de replici și schimbul de ramuri a fost efectuat utilizând reconectarea cu bisecție-arbore (TBR). S-au ținut maximum 10 copaci în fiecare etapă cu adăugiri secvențiale aleatorii pentru arborele de pornire în fiecare repetare. Arborii din prima rundă au fost supuși unei a doua căutări prin schimbarea TBR cu o capacitate de până la 15.000 de copaci și schimbarea pentru finalizare. Fiabilitatea nodului a fost evaluată printr-un test bootstrap cu 1000 de pseudo-replici 69, 70, 71. H. indicus a fost folosit ca grup outgroup pentru toate metodele.

Disponibilitatea datelor

GenBank (NCBI) [//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank] Numerele de acces pentru secvențele de nucleotide sunt date în Tabelul 2. Alinierea secvenței a fost arhivată în proiectul BOLD [//www.boldsystems.org] DS-CRCB (dx.doi.org/10.5883/DS-CRCB).

Mulțumiri

Autorii sunt recunoscători directorului, CSIR-CIMAP, Lucknow, pentru încurajarea sa și oferirea de facilități de laborator pentru studiu. Sprijin financiar din partea Consiliului de cercetare științifică și industrială (CSIR), New Delhi, India prin XII. Proiectele FYP Biopros-PR (BSC-0106) și ChemBio (BSC-0203) sunt recunoscute cu recunoștință.

Material suplimentar electronic

Cod de bare bazat pe caractere pentru autentificarea și conservarea IUCN Specii pe cale de dispariție din genul Decalepis (Apocynaceae) \ t

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă considerați că acesta este un act ofensator care nu este conform cu termenii sau liniile directoare, vă rugăm să îl marcați ca fiind inadecvat.