obiecte

abstract

Conjugații anticorp-medicament (ADC) sau imunoconjugații s-au dovedit a fi o nouă clasă de medicamente pentru terapia țintită împotriva cancerului 1, 2. ADC este un sistem cu trei componente în care un anticorp monoclonal terapeutic (mAb) și un medicament citotoxic puternic cu molecule mici sunt conjugați printr-un linker stabil. MAb recunoaște în mod specific un antigen/receptor de suprafață pe celulele canceroase care blochează transducția semnalului. Între timp, complexul ADC este interiorizat în celulele canceroase, unde anticorpul este degradat și medicamentul citotoxic este eliberat. Acest design unic nu numai că reduce semnificativ efectele secundare ale medicamentelor citotoxice, dar permite și îmbogățirea medicamentelor citotoxice din celulele canceroase 3. Două ADC, brentuximab vedotin și adotrastuzumab emtansine, au fost aprobate de FDA pentru tratamentul limfomului și cancerului de sân 1. Multe ADC sunt în prezent în studii clinice pentru tratamentul cancerului 4 .

Am fost fascinați de designul ADC, am întrebat dacă o strategie similară ar putea fi utilizată pentru a trata obezitatea, vizând organele metabolice. Deoarece nu există anticorpi stabiliți pentru proiectarea ADC, am apelat la oligonucleotidele antisens (ASO) ca înlocuitor potențial pentru anticorpi. ASO-urile sunt molecule ADN monocatenare scurte modificate care reglează expresia genelor în principal în ficat și grăsime 5, 6, 7. ASO au o biodisponibilitate foarte scăzută la nivelul mușchilor scheletici și cardiaci, creierului, pancreasului, după administrarea sistemică 6, 7, 8. De fapt, s-au depus eforturi considerabile pentru a proiecta modificări ale ASO pentru a îmbunătăți penetrarea în alte organe decât ficatul și grăsimile 9. Această limitare a ASO la tratamentul bolilor neurologice, musculare și cardiace pare a fi avantajoasă în proiectarea conjugatului ASO-medicament pentru grăsimea și ficatul țintă pentru tratamentul obezității. Un alt aspect important în selectarea ASO este că, la fel ca absorbția celulară a ADC, internalizarea ASO s-a dovedit a fi în mare parte prin endocitoză 10, 11 .

Creșterea cheltuielilor cu energia este principala strategie pentru tratarea obezității. Hormonul tiroidian T3 este foarte puternic în creșterea ratei metabolice bazale și inducerea rumenirii țesutului adipos alb 12, 13. Pierderea în greutate este un simptom major al hipertiroidismului la om14. Cu toate acestea, hormonul tiroidian este contraindicat pentru tratamentul obezității datorită efectelor sale sistemice asupra creierului, inimii și mușchilor, care provoacă anxietate, insuficiență cardiacă și pierderi musculare 14. Deoarece ASO-urile pătrund foarte prost în aceste organe, presupunem că conjugatele ASO-T3 reduc efectele hormonilor tiroidieni în aceste organe.

O altă întrebare este ce linker să utilizați pentru a conjuga ASO și T3. Am ales sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilat (Sulfo-SMCC), un agent de reticulare non-clivabil și impermeabil la membrană datorită selectivității sale ridicate, cineticii de reacție rapidă și compatibilității cu condițiile de reacție apoasă., Sulfo-SMCC conține o N-hidroxisuccinimidă reactivă la amină (ester NHS) și o grupare maleimidă reactivă sulfhidril. Grupa maleimidă sulfo-SMCC este neobișnuit de stabilă datorită punții de ciclohexan din brațul distanțier. Acest lucru crește semnificativ stabilitatea ADC a medicamentului în circulație. Sulfo-SMCC este utilizat pe scară largă în sinteza ADC, inclusiv adastrastuzumab emtansină aprobat de FDA.

Apoi am testat două ASO-uri stabilite. Nicotinamida N-metiltransferază (NNMT) este un modulator al metilării histonelor care reglează consumul de energie celulară în țesutul adipos 16, 17. Tratamentul NNMT-ASO previne obezitatea indusă de dietă 16. Medicamentul aprobat de FDA Mipomersen este un ASO împotriva apolipoproteinei B (ApoB) pentru tratamentul hipercolesterolemiei cunoscute 5. Folosind conceptul de proiectare ADC, am sintetizat noi compuși prin conjugarea chimică a NNMT-ASO și ApoB-ASO cu hormonul T3 folosind un linker sulfo-SMCC. Am investigat apoi efectele bioconjugatelor ASO-T3 asupra obezității.

Rezultatul

Sinteza și funcția ASO-T3

Hormonul tiroidian T3 a reacționat mai întâi cu sulfo-SMCC pentru a forma T3 activat cu maleimidă. Produsul a fost apoi conjugat cu fosforotioat modificat cu NNMT-ASO sau ApoB-ASO (Fig. 1a). Produsele NNMT-ASO-T3 (NAT3) și ApoB-ASO-T3 (AAT3) nu prezintă T3 liber sau T3-SMCC detectabil (Figura Adițională 1a-d). Conjugarea cu succes a ASO și T3 a fost verificată de MALDI-TOF MS (Figura suplimentară 2a, b). Am investigat apoi dacă conjugatele ASO-T3 ar putea păstra funcționalitatea ASO și T3. Reporterul a activat receptorii hormonului tiroidian NAT3 și AAT3 (Fig. 1b, c). Efectele au fost atenuate prin tratamentul cu clorochină, un inhibitor al acidificării lizozomilor, sugerând că lizozomul joacă un rol important în activitatea T3 NAT3 și AAT3 (Fig. 1b, c). Activitatea ASO în conjugatele ASO-T3 pare să fie dependentă de țintă. AAT3 a redus expresia ApoB într-un grad similar cu ApoB-ASO (AA) în hepatocitele cultivate (Fig. 1d), în timp ce NAT3 nu a reușit să suprime expresia NNMT în hepatocitele cultivate, adipocitele (nu sunt prezentate) sau țesutul adipos (Fig. 1e). Deoarece NAT3 nu are activitate NNMT-ASO și se știe că ApoB-ASO nu are niciun efect asupra greutății corporale la animale și oameni 18, 19, ne-am concentrat asupra studierii efectelor AAT3 și NAT3 asupra cheltuielilor de energie și pierderii în greutate.

conjugate

Efectele ASO-T3 asupra expresiei genelor în organele metabolice. ( A, b ) Markeri de rumenire (Ucp1, Pgcla, Cidea, Cox7a1 și Cox8b) în țesutul adipos alb inghinal (iWAT). ( c ) Exprimarea Ucp1 în țesutul adipos alb epididim (eWAT). ( d ) Exprimarea unei familii de 6 purtători 6 dintr-un purtător dizolvat (Scl6a8), glicină amidinotransferază (Gamt) și mitocondrii creatin kinazei 2 (Ckmt2) în eWAT. ( e ) Exprimarea markerilor genetici ai țesutului adipos maro (BAT). ( f ) Expresia hepatică a hormonului tiroidian (Dio1) și a genei deodinazei-1 responsive a colesterolului 7alfa-hidroxilază (Cyp7a1). ( g ) Gene gluconeogene (G6pase, Pepck) și gene de sinteză a acizilor grași (Acc1, Acc2 și Fas) în ficat. ( h, eu ) Expresia Mhc-b ( h ) și Mhc-a și Troponin (Trop) ( eu ) in inimă. ( j ) Exprimarea Serca1 și Searca2a în mușchi. NAT3: NNMT-ASO-T3; AAT3: ApoB-ASO-T3. n = 4-6 per grup; * p § p = 0,07 vs control, # p

Efectele ApoB-ASO-T3 (AAT3) asupra nivelurilor LDL. ( A ) Apolipoproteina ficatului B (ApoB) nivelurile de ARNm. b ) Nivelurile LDL serice. AA: ApoB-ASO. n = 5-6 per grup; * p # p 25. Multe medicamente, cum ar fi hormonii tiroidieni și agoniștii receptorilor adrenergici, sunt destul de puternici în creșterea cheltuielilor de energie 26, 27, 28. Cu toate acestea, efectele sistemice ale acestor medicamente interzic utilizarea lor în tratamentul obezității. Situația este similară cu un medicament citotoxic pentru tratamentul cancerului. Deși medicamentele citotoxice sunt eficiente în distrugerea celulelor canceroase, ele afectează în mod semnificativ țesuturile normale. Arta proiectării medicamentelor ADC aduce o revoluție terapeutică în tratamentul cancerului, permițând livrarea țintită a medicamentelor citotoxice către celulele canceroase. Folosind conceptul de proiectare ADC și profitând de țintirea adipă și hepatică a ASO, am dezvoltat cu succes conjugatele ASO-T3. Recent, conjugarea hormonului hibrid glucagon-T3 a fost raportată că vizează selectiv țesutul adipos și ficatul, ducând la o pierdere în greutate remarcabilă și la îmbunătățirea sindromului metabolic la șoarecii obezi 29 Prin urmare, un nou design de medicamente pentru inducerea hipertiroidiei grase și hepatice poate duce la o nouă direcție în dezvoltarea medicamentelor pentru tratamentul obezității și a sindromului metabolic.

Rezultatul ideal al designului ASO-T3 este menținerea activității ASO și T3, astfel încât ASO să poată coagula gena țintă și T3 să poată activa receptorii hormonului tiroidian din grăsimi și ficat. Scopul este de a realiza efecte sinergice ale ASO și T3 asupra îmbunătățirii metabolismului glucozei, lipidelor și energiei. Cu toate acestea, conjugarea moleculelor mici cu ASO poate afecta stabilitatea și activitatea ASO 29, 30. Pentru cele două conjugate ASO-T3 pe care le-am testat, numai ApoB-ASO-T3 păstrează activitatea ASO, în timp ce NNMT-ASO-T3 nu poate reseta NNMT. Prin urmare, selectarea și testarea atentă a ASO este importantă pentru conjugarea cu succes ASO-T3.

Deși atât T3 cât și ASO-T3 cresc cheltuielile de energie, doar șoarecii tratați cu ASO-T3 prezintă greutate corporală redusă și adipozitate. Spre deosebire de scăderea în greutate la persoanele cu hipertiroidism, șoarecii eutiroidați tratați cu T3 nu pierd în mod sistematic, ci se îngrașă. Acest lucru se datorează în mare parte efectelor directe ale T3 asupra hipotalamusului asupra stimulării consumului de alimente și efectelor asupra intestinului de a crește absorbția nutrienților la șoareci 20, 21, 22. În ciuda hrănirii duble, cheltuielile de energie și absorbția par a fi echilibrate la șoarecii tratați cu T3. Cu toate acestea, T3 circulant nu este crescut la șoarecii tratați cu ASO-T3. Astfel, nu există niciun efect sistemic al T3 pentru a compensa creșterea cheltuielilor de energie, ceea ce duce la pierderea în greutate și la reducerea adipozității.

O considerație importantă a utilizării ASO ca vector de aderare a țesutului este că ASO-urile de tip anticorp din ADC sunt internalizate în celulele țesuturilor prin endocitoză in vivo 10, 11 (Fig. 4c). Procesul fiziologic al endocitozei nu afectează integritatea membranei plasmatice celulare și, prin urmare, este mai puțin toxic. Intracelular, ASO-urile sunt fie degradate direct în lizozomi, fie hibridizate la ARN și degradate de nucleaze 10, 31, 32. Inhibarea acidificării lizozomilor de către clorochină a scăzut, dar nu a abrogat complet activitatea T3 (Fig. Lb, c), sugerând că ambele căi ar putea fi implicate în disocierea ASO și T3 în celulele cultivate.

Pe scurt, folosind principiul ADC, am proiectat cu succes conjugatele ASO-T3 și am demonstrat că ASO-T3 poate reprezenta o nouă strategie de dezvoltare a medicamentelor pentru tratamentul obezității. Important, ApoB-ASO (Mipomersen) este un medicament aprobat de FDA cu profiluri de siguranță stabilite pentru tratamentul hipercolesterolemiei cunoscute. Conjugatul ApoB-ASO-T3 poate fi utilizat la pacienții cu obezitate generală cu hipercolesterolemie.

Materiale și metode

Sinteza ASO-T3

ASO 16, 19 modificat cu fosforotioat (mouse NNMT-ASO: 5-GAAATGAACCAGCAGGCCTT-3 și mouse ApoB-ASO: 5-GTCCCTGAAGATGTCAATGC-3) cu un linker 5'-tiol și C6 amino au fost sintetizate prin Bio-Synthesis (Lewisville, Texas) ). ). Hormonul tiroidian T3 a reacționat mai întâi cu sulfo-SMCC pentru a forma T3 activat cu maleimidă. După purificare prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă (RP-HPLC), T3-SMCC în exces este reacționat cu oligonucleotide funcționalizate cu tiol pentru a forma conjugați ASO-T3. Conjugații au fost purificați prin RP-HPLC și caracterizați prin MALDI-TOF MS.

Activitatea receptorului hormonului tiroidian

Celulele HEK293T au fost menținute în mediul Eagle modificat de Dulbecco, suplimentat cu L-glutamină, ser de vițel fetal fără hormoni steroizi 10%, penicilină și streptomicină. Transfecțiile tranzitorii au fost efectuate în plăci cu 6 godeuri de celule subconfluente. S-au efectuat transfecții în două etape, deoarece nu a putut fi măsurată nicio activitate de luciferază atunci când plasmidele au fost cotransfectate cu ASO (nu este prezentat). Plasmidele, inclusiv receptorul alfa al hormonului tiroidian (100 ng), receptorul beta al hormonului tiroidian (100 ng), receptorul hormonului tiroidian DR4-luciferaza (100 ng) și PRL-TK (10 ng) au fost mai întâi transfectate în celule HEK293T folosind reactiv de transfecție FuGENE. HD (Roche) 40. Douăsprezece ore mai târziu, celulele au fost transfectate cu ASO-T3 (1 μM). Activitatea luciferazei a fost măsurată la 36 de ore după transfecția ASO-T3. Activitatea luciferazei indusă de luciferază condusă de DR4 a fost normalizată la activitatea luciferazei Renla condusă de PRL-TK. S-a adăugat clorochină (100 μM) pentru a inhiba acidificarea lizozomului cu 6 ore înainte de măsurarea activității luciferazei. T3 (1 nM) a fost adăugat cu 24 de ore înainte de colectarea celulelor pentru controale pozitive ale activității reporterului de hormoni tiroidieni.

Tratamentul ASO-T3 la șoareci

Șoarecii C57BL/6 de tip sălbatic au fost achiziționați de la Laboratorul Jackson și plasați într-un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumini de la 7:00 la 19:00). Șoarecii au fost tratați mai întâi cu o dietă bogată în grăsimi (Research Diets D12331, 5, 56 kcal/gm) timp de 12 săptămâni. S-a efectuat un RMN pentru compoziția corporală de bază. Șoarecii au fost apoi tratați cu control PBS, T3 (200 μg/kg) sau ASO-T3 (25 mg/kg) de două ori pe săptămână. Studiile cuștilor metabolice au fost începute din ziua 7, când nu a existat nicio diferență în greutatea corporală. RMN-ul repetat a fost efectuat la trei săptămâni după tratament. Studiile la șoareci au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare federale și au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Universitatea din California Irvine și Universitatea din Carolina de Est.

Măsurători serice T3

Serul T3 a fost măsurat prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă tandem (LC-MS/MS) 41, 42. Optzeci de microlitri de ser de la șoareci tratați cu T3 sau ASO-T3 timp de două ore au fost amestecați cu acid ascorbic, acid citric și ditiotreitol (25 μg/μl) pentru a preveni conversiile potențiale ale hormonilor tiroidieni. După o oră de incubare pe gheață, s-au adăugat 640 μl de uree și soluția a fost incubată timp de o oră la 50 ° C. Probele au fost apoi supuse extracției în fază solidă înainte de injectarea în LC-MS/MS. Separarea a fost realizată folosind GP-fenil (3 μm, 2,1 x 100 mm). Faza mobilă cu gradient a constat din 0,1% acid formic în apă (A) și acetonitril (B) și debitul a fost ajustat la 0,2 ml/min. Detectarea spectrometriei de masă a fost efectuată pe un spectrometru de masă în trei trepte cu un spectrometru TSQ Vantage în trei trepte, tensiune de pulverizare: 3,2 KV, temperatura evaporatorului: 200 ° C, presiunea gazului de manta: 45 arb, presiunea gazului Aux: 15 arb, temperatura: 270 ° C. Cuantificarea a fost efectuată prin monitorizarea reacțiilor selectate (SRM) în modul de ionizare pozitivă și parametrii sunt m/z 651, 517 → 508.000 pentru T3 (CE 22 eV; lentilă S la 161 V), 461, 095 → 285, 056 pentru IS (CE 19 eV, obiectiv S la 88 V).

Fizic

Compoziția corpului a fost analizată la șoareci tratați cu control PBS, T3, NNMT-ASO-T3 sau ApoB-ASO-T3 timp de 3 săptămâni folosind un instrument EchoMRI 3-în-1 (Echo Medical Systems, Houston, TX).

Cuști metabolice

Cheltuielile cu energia au fost evaluate utilizând sistemul TSE PhenoMaster. Șoarecii hrăniți cu HFD au fost tratați cu PBS, T3, NNMT-ASO-T3 sau ApoB-ASO-T3 martor timp de 7 zile. Șoarecii au fost aclimatizați în cuști metabolice cu 2 zile înainte de experimente. Producția de CO2 și consumul de O2 au fost colectate la fiecare 60 de minute pentru fiecare șoarece timp de 3 până la 4 zile. Nivelurile au fost normalizate până la masa slabă. Aportul și activitatea alimentară au fost măsurate la intervale regulate.

Măsurători ale glucozei serice, insulinei și LDL

Nivelurile de glucoză au fost măsurate utilizând un test colorimetric al glucozei (Cayman Chemicals). Insulina a fost măsurată cu un kit ELISA pentru insulină cu ultrasunete (Crystal Chem). LDL se măsoară folosind kitul LDL Assay de la BioAssay Systems.

Extracția ARN și PCR cantitativă

Țesutul adipos și ARN-ul din ficat au fost extrase folosind RNeasy Mini Kit (Qiagen). ARN din inimă și mușchi a fost extras folosind kitul RNeasy Fibrous Tissue Mini (Qiagen). Celulele de hepatom de șoarece Hepa1-6 au fost transfectate cu ASO și ASO-T3. ARN-ul a fost extras la 48 de ore după transfecție. PCR-urile SYBR în timp real au fost efectuate așa cum s-a descris mai sus 43. Primerii sunt enumerați în tabelul suplimentar-1.

Test statistic

Toate datele sunt exprimate ca media ± sem. Au fost efectuate analize de împrăștiere, urmate de teste posthoc Bonferroni-Holm pentru comparații multiple. Semnificație statistică pentru p