obiecte

abstract

fundal

Copiii cu boli cardiace cianotice dezvoltă eritrocitoză secundară și trombocitopenie prin mecanisme necunoscute. Microcitele eritrocitare mature pot reflecta patologiile clinice și procesele de preenucleație ale diferențierii celulare. Acest studiu a evaluat microARN-urile eritrocitare la copiii cu boli cardiace cianotice.

metode

MicroARN-ul eritrocitar la copiii cu și fără boli cardiace cianotice și acianotice a fost cuantificat prin sistemul Ion PGM (n = 10 per grup). Expresia diferențială a fost confirmată prin PCR cantitativă (qPCR; n = 20 per grup).

Rezultatul

Mir-486-3p, mir-486-5p și mir-155-5p au fost crescute la pacienții cu boli cardiace cianotice comparativ cu pacienții fără boli cardiace: diferențe multiple (interval de încredere 95%): mir-486-3p: 1, 92 (1, 14 –3, 23), P = 0, 011; mir-486-5p: 2, 27 (1, 41-3, 65), celule P 108 folosind hemoleucograma completă. Gama de dimensiuni a microARN-ului a fost confirmată și ARN-ul de 2 ng a fost cuantificat folosind un Bioanalyzer și un kit Agilent Small RNA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Bibliotecile complementare de ADN au fost construite folosind kitul Torrent ARN-seq v.2 Ion (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) pentru bibliotecile mici de ARN conform instrucțiunilor producătorului și puritatea și concentrația acestora au fost confirmate folosind un Bioanalizator cu un kit ADN Agilent (Agilent Tehnologii).

Secvențierea bibliotecii MicroRNA a fost efectuată pe un cip 318 folosind un sistem Ion Personal Genome Machine (ThermoFisher Scientific). Toate citirile brute au fost trunchiate automat pentru a elimina adaptoarele, aliniate la genomul uman (hg19 GRCh37) și adnotate cu Torrent Suite 1.5 (TMAP) cu parametrii impliciți. ARN-urile mici și necodificatoare au fost clasificate în funcție de tipurile de gene. Am identificat secvențe cu baza de date microRNA miRBase 21 (//www/mirbase.org/).

Izolarea ARN-ului total și a qPCR (faza de validare)

Am efectuat qPCR pentru a determina microARN-ul matur și pentru a verifica rezultatele secvențierii generației următoare. ARN-ul total a fost extras din 2,7 ml de celule sanguine ale pacientului folosind RNeasy Plus Mini Kit și RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. ARN a fost cuantificat de la 1,0 x 108 celule folosind un fluorometru Quantus (Promega KK, Tokyo, Japonia), iar concentrația fiecărei probe a fost de 0,2 ng/μl. Molecule mici de ARN, 5'-UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA-3 ', au fost îmbogățite în probe și utilizate ca control.

ADN-ul complementar a fost preparat folosind kitul ABI Taqman pentru sinteza avansată a ADN-ului complementar de microARN (ThermoFisher Scientific). Analiza qPCR a fost efectuată folosind Step One Plus (ThermoFisher Scientific). A fost utilizat un câștig de 40 de ori la pragul ciclului (valori Ct = 40). Am exclus microARN-urile din comparațiile de grup atunci când au fost observate probe nedeterminate (valori Ct> 40) care depășeau trei probe. Metoda ACCt a fost utilizată pentru a analiza valorile expresiei.

analize statistice

Analiza empirică a expresiei genei digitale utilizând CLC Genomic Workbench versiunea 8.5.1 (Qiagen) a fost utilizată pentru a compara rezultatele expresiei microARN din secvențierea generației următoare. Valorile P corectate pentru constatări false (valori FDR-P) mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative în analiză.

Valorile expresiei qPCR au fost comparate printr-o analiză unidirecțională a varianței, urmată de analiza post-hoc a lui Tukey. Variabilele din trei grupuri au fost supuse unui test normal pentru a determina distribuția datelor. Datele distribuite în mod normal sunt exprimate ca mijloace (SD), iar datele distribuite nestandard sunt exprimate ca mediana primului și celui de-al treilea quartile (quartile 1 și quartile 3). Variabilele au fost analizate folosind testul de comparație multiplă al lui Tukey pentru datele distribuite în mod normal și testul Dunn pentru datele distribuite în mod normal. Valorile P mai mici de 0,05 au fost considerate semnificative. Analizele statistice au fost efectuate folosind Stat-Flex versiunea 6.0 (Artech, Osaka, Japonia) și Graph Pad Prism 7.00 (Graphpad Software, La Jolla, CA).

Estimăm că 10 pacienți pe grup au fost dimensiunea eșantionului adecvat pentru faza exploratorie pe baza unui studiu anterior (20, 21). Estimarea mărimii eșantionului pentru faza de validare qPCR s-a bazat pe a = 0,05, β = 0,2 și dimensiunea efectului = 0,5, cu trei grupuri, folosind puterea G * 3.1.9.2 (//www.gpower.hhu. De /) . Au fost necesari paisprezece pacienți pe grup. Prin urmare, am inclus 20 de pacienți în grup.

Rezultatul

Secvențierea următoarei generații (faza de explorare)

Tabel în dimensiune completă

contribuția

Graficul vulcanic al fiecărei grupe de comparație și harta de căldură a celor trei grupuri. ( A ) Sunt raportate denumirile microARN-urilor cu valori P corectate de FDR (valori FDR-P) mai mici de 0,05. MicroARN-urile au fost recunoscute ca secvențe de tip loop-tulpină. Pentru mir-1260a și mir-1260b, buclele stem și secvențele mature au prezentat corespondență unu-la-unu. Baza de date microRNA utilizată a fost miRBase 21 (//www/mirbase.org/). ( b ) Întreaga hartă a căldurii este afișată în dreapta. Zona de expresie înaltă este extinsă spre stânga. Mir-486-1 și mir-486-2 arată în mod clar un contrast în grupurile de boli cardiace congenitale cianotice și grupuri de boli cardiace congenitale comparativ cu grupul martor. FDR, constatare falsă.

Imagine la dimensiune completă

qPCR (faza de verificare)

Tabel în dimensiune completă

MicroARN diferențiali într-o comparație în trei grupuri validată de qPCR. Mir-486-3p, mir-486-5p și mir-155-5p au fost semnificativ crescute în grupul bolilor cardiace congenitale cianotice. * Celulele P + (în amonte de diferențierea hematopoietică) și inhibă suprimarea celulelor CD34 + normale in vitro și in vivo (23) Creșterea mir-486-5p este considerată a fi un mecanism de compensare a hipoxiei cronice a țesuturilor prin creșterea hemocitelor circulante. Copiii cu boală cardiacă acianotică nu au avut un scurtcircuit de la dreapta la stânga, dar au suferit adesea de hipoxie tisulară cronică din cauza hipoperfuziei sistemice cauzată de scurtcircuit de la stânga la dreapta. O creștere atât a hemocitelor circulante, cât și a volumului de sânge poate fi, prin urmare, mai avantajoasă ca mecanism compensator pentru creșterea mir-486-3p și mir-155-5p (în aval de diferențierea hematopoietică) în prezența bolilor cardiace congenitale. Ca rezultat, este în concordanță cu tendința conform căreia copiii cu boli cardiace acianotice nu dezvoltă, în general, eritrocitoză sau trombocitopenie (4).

Mir-155 este un microARN indus de hipoxie (24, 25). Modulează megacariopoieza și supraexpresia sa inhibă diferențierea megacariocitelor prin reglarea factorilor de transcripție Meis-1 și Ets-1 (26). Prin urmare, supraexprimarea mir-155 poate explica eritrocitoza și trombocitopenia la copiii cu boli cardiace cianotice. Mir-155 este, de asemenea, cunoscut pentru a regla hexokinaza II și creșterea sa promovează producția de hexokinază II și proteine ​​(27). Glicoliza anaerobă oferă în primul rând energie eritrocitelor, deoarece mitocondriile sunt eliminate din reticulocite în ultima etapă a diferențierii eritrocitelor (28).

Interesant este că mir-155 facilitează nu numai eritrocitoza, ci și glicoliza anaerobă în eritrocite, care la rândul său favorizează adaptarea la hipoxie. În plus, mir-155 este exprimat în limfocite, celule endoteliale și celule musculare netede (29, 30, 31). Recent, s-a demonstrat că mir-155 are funcții atât antiangiogene, cât și pro-arteriogene prin receptorul angiotensinei II tip 1 în celulele endoteliale și supresorul receptorului 1 de semnalizare citokină din macrofage (32). Când copiii cu boli cardiace cianotice dezvoltă circulație colaterală, cum ar fi artera colaterală aortopulmonară principală, mir-155 poate facilita neovascularizarea.

Deși au fost propuse explicații pentru condițiile patologice ale bolilor cardiace cianotice, mecanismul rămâne neclar (4, 33, 34, 35). Mecanismul asociat microRNA care implică mir-486-3p, mir-486-5p și mir-155-5p poate fi cea mai potrivită explicație până în prezent. Acest lucru este susținut de faptul că un număr redus de trombocite reticulate în bolile cardiace congenitale cianotice, în ciuda nivelurilor normale de trombopoietină (4) și a eritropoiezei crescute, persistă după o creștere inițială a nivelurilor de eritropoietină (6). La șoareci, plămânul s-a dovedit recent a fi un alt loc primar de producție terminală de trombocite, în care megacariocitele migrează din măduva osoasă și eliberează trombocite (36). Prin urmare, scurtcircuitarea pe partea dreaptă induce megacariocitul „scurtcircuit” și poate accelera trombocitopenia (Figura 3).

Schema unui posibil mecanism de anomalii ale sângelui în bolile cardiace congenitale. O creștere a mir-486-5p crește diferențierea celulelor CD34 + (în amonte de diferențierea hematopoietică). Creșterea mir-486-3p și mir-155-5p induce diferențierea celulelor progenitoare megacariocitare și a celulelor progenitoare eritroide (în aval de diferențierea hematopoietică). Scurt-circuitul dreapta-stânga induce megacariocitul „scurtcircuit” și poate accelera trombocitopenia (36).

Imagine la dimensiune completă

Studiile anterioare au arătat că hipoxia cronică inhibă expresia și activitatea Dicer, care procesează microARN-urile precursoare în formele lor mature (37, 38, 39). Astfel, expresia microARN-urilor mature a scăzut în general odată cu acumularea pre-microARN-urilor în hipoxia cronică. În contrast, atât mir-155, cât și pre-mir-155 cresc odată cu hipoxia și Knockdown Dicer (27); mir-486-3p și -5p s-ar putea comporta similar în acest studiu. Dicerul rezidual pare să proceseze preferențial astfel de pre-microARN-uri, altfel degradarea lor ar fi întârziată în hipoxie, dar mecanismul detaliat rămâne neclar (27).

De asemenea, rămâne neclar dacă mir-1260a și let-7e-5p, care au fost reduse la copiii cu afecțiuni cardiace acicotice, contribuie la diferențierea celulelor sanguine. Reglarea descendentă a let-7e-5p circulant a fost identificată la pacienții cu defecte septale ventriculare, sugerând că joacă un rol de reglementare în dezvoltarea defectelor septale ventriculare (40). Majoritatea pacienților cu grupul acianotic au fost în studiul actual al pacienților cu defect septal ventricular, iar reglarea descendentă a let-7e-5p a putut fi observată și în eritrocite. Am rezumat genele legate de diferențierea celulelor sanguine, care sunt ținte supuse microRNA-urilor pentru a susține studii suplimentare (Tabelul 3).

Tabel în dimensiune completă

Limita acestui studiu este că a fost pur observațional. Nu am efectuat analize funcționale ale microARN-urilor semnificative care să ofere dovezi directe ale anomaliilor sanguine care apar la pacienții cianotici. Prin urmare, sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida mecanismul complex al combinației de microARN. Mir-155-3p, mir-140-5p și mir-296 (-3p și -5p) au fost excluse din comparația celor trei grupuri qPCR pentru precizie statistică, deoarece mai multe eșantioane aveau valori Ct nedefinite (valori Ct> 40) . Poate fi mai avantajos să modificați pragul Ct pentru detectarea acestor microARN-uri. Aproape jumătate din probele mir-140-5p din loturile martor și acianotice nu au atins pragul, deși a fost observată o curbă de amplificare. Acest lucru se poate datora faptului că nivelul mir-140-5p a fost în general scăzut și dificil de detectat în condiții nepatologice. Pentru astfel de microARN-uri, generarea de secvențe de secvențe de generația următoare poate ajuta la identificarea modificărilor de urmărire.

O altă limitare este că durata și întinderea cianozei au variat în rândul pacienților cianotici implicați, ceea ce ar putea afecta producția de microARN. Gradele de trombocitopenie și eritrocitoză nu au fost chiar severe în grupul nostru cianotic. Acest lucru se poate datora procedurilor chirurgicale efectuate mai devreme decât cele descrise anterior (4, 33, 34, 41), limitând astfel durata hipoxiei cronice, în concordanță cu o creștere remarcabilă a mir-155, un microARN indus de hipoxie, în secvențierea următoarelor generație și qPCR. În plus, o intervenție chirurgicală mai timpurie poate duce la pacienții incluși în grupurile cianotice și acianotice să fie mai tineri decât pacienții din grupul de control. În plus, mir-486-5p a prezentat o schimbare semnificativă la copiii cu boli cardiace cianotice. Creșterea celulelor CD34 + normale și diferențierea eritroidă a mir-486-5p pot masca efectul inhibării diferențierii megacariocitelor mir-486-3p și mir-155-5p. În cele din urmă, reticulocitele nu au fost eliminate în acest studiu, deși aceste cifre au fost similare în toate cele trei grupuri.

În cele din urmă, nivelurile de expresie ale mai multor microARN în eritrocite au fost semnificativ crescute sau scăzute la copiii cu boli cardiace cianotice și acianotice. Mai multe forme, inclusiv mir-486-3p, mir-486-5p și mir-155-5p, pot contribui la dezvoltarea eritrocitozei secundare și a trombocitopeniei la copiii cianotici după hipoxie.

Informatii suplimentare

Documente Word

Tabel suplimentar S1

Tabel suplimentar S2

CONTRIBUȚIILE AUTORULUI

NM și Yo.N .: proiectarea studiului, recrutarea pacienților, colectarea datelor, analiza datelor și scrierea proiectului inițial al manuscrisului; SM, TM, TS și Ya.N.: proiectarea studiului, interpretarea datelor și scrierea manuscrisului original; TT: proiectarea studiului și elaborarea proiectului original al manuscrisului; DIS: proiectarea studiului (supravegherea abordării statistice) și revizuirea critică a manuscrisului pentru un conținut intelectual important; SI, SO și NT: recrutarea pacienților, colectarea datelor și scrierea inițială a manuscriselor.

Declarația de sprijin financiar

Această lucrare a fost parțial susținută de subvenții pentru sprijinirea cercetării științifice a Ministerului Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologiei din Japonia (Nr. 26462370, 15K21287, 15K10542 și 17K11093).