celulare

  • abstract
  • scopul:
  • metode:
  • rezultatele:
  • concluzie:
  • introducere
  • Rezultatul
  • Generarea de linii celulare CD44-pozitive de cancer colorectal
  • Celulele P6C ​​exprimă gene de tulpină
  • Autoînnoirea și diferențierea celulelor P6C
  • Instabilitate cromozomială și mutații în p53 în celulele P6C
  • Tumoră xenogrefă holoconică derivată dintr-o singură celulă
  • Rezistența la medicamente a celulelor P6C
  • discuţie
  • Contribuția autorului
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere imagine
  • Imagine suplimentară S1
  • Imagine suplimentară S2
  • Imagine suplimentară S3
  • Imagine suplimentară S4
  • Imagine suplimentară S5
  • Imagine suplimentară S6

abstract

Celulele stem canceroase sunt capabile să inițieze și să mențină creșterea tumorii. În acest studiu, am stabilit linia de celule stem pentru cancerul colorectal CD44 +, cu accent special pe capacitatea sa de auto-reînnoire, inițierea crescută a tumorii și rezistența la medicamente.

metode:

Cancerul de colon proaspăt și țesuturile de colon normale asociate au fost colectate de la 13 pacienți care nu au fost supuși chimioterapiei sau radioterapiei înainte de operație. Din cele 6 clone derivate dintr-o singură celulă, numai linia celulară P6C a fost cultivată pentru mai mult de 20 de pasaje în cultura în serie și s-au format holocloni de înaltă eficiență, urmate de expresia genică a tulpinilor stem, formarea coloniilor, tumorigenicitatea și sensibilitatea la medicament. pe linia de celule P6C. au fost examinate.

rezultatele:

Tulpinile de proteine, inclusiv c-Myc, Oct3/4, Nanog, Lgr5 și SOX2, au fost extrem de exprimate în linia celulară P6C. Celulele P6C ​​oct3/4-pozitive au generat în mare parte holocloni prin diviziune simetrică, în timp ce un număr mic de celule P6C ​​au generat mercloni prin diviziune asimetrică. Celulele P6C ​​au exprimat stabil CD44 și au o capacitate mare de a forma sfere tumorale. O sferă cu o singură celulă a fost capabilă să genereze tumori xenogrefe la șoareci goi. Comparativ cu celulele carcinomului colorectal SW480 și HCT116, celulele P6C ​​au fost extrem de rezistente la camptotecină și 5-fluorouracil, agenți chimioterapeutici utilizați în mod obișnuit pentru tratamentul cancerelor colorectale.

concluzie:

Am dezvoltat o linie de celule stem P6C de colon și cancer rectal cu capacitate tumorigenică ridicată și caracteristici normale ale celulelor stem. Acest lucru va fi benefic pentru studiile mecanice ale celulelor stem canceroase și dezvoltarea de medicamente care vizează în mod specific celulele stem canceroase.

Rezultatul

Generarea de linii celulare CD44-pozitive de cancer colorectal

Am colectat țesuturi proaspete de cancer de colon și s-au asociat țesuturi normale de colon de la 13 pacienți care nu fuseseră supuși chimioterapiei sau radioterapiei înainte de operație. Țesuturile au fost măcinate în DMEM și incubate cu 1 mg/ml colagenază și 1 mg/ml hialuronidază timp de 1 oră. Suspensia celulară a fost placată în baloane de 25 cm 2 conținând DMEM suplimentat cu 10% FBS și plăci ultraviolete care conțin DMEM suplimentat cu 5% FBS. Celulele colonului și rectal de la opt pacienți au format sfere în vase de atașament ultra-subțire (Corning, # 3262) timp de 25 de zile (Figura 1A). În schimb, în ​​aceleași condiții de cultură, celulele izolate din țesuturi normale de colon împerecheate nu au format sfere. În schimb, celulele normale ale colonului au suferit o divizare celulară limitată înainte de senescență (Figura 1A). Apoi am izolat celule canceroase individuale din margele și am implantat aceste celule la o concentrație de 0,5 celule pe godeu într-o placă cu 96 de godeuri. Patru clone derivate dintr-o celulă (denumite P6C, P7C, P8C, P13C-1, P13C-2 și P13C-3) au fost generate de la patru pacienți. Dintre acestea, numai linia P6C a fost cultivată pentru mai mult de 20 de pasaje în cultura în serie și a format holocloni de înaltă eficiență 14, 15 (Figura 1A).

90% când celulele au fost cultivate pe plăci (Figura 1D). În schimb, nivelurile de expresie ale markerilor epiteliali intestinali diferențiați, inclusiv CDX2, citokeratina 1 (CK1) și CK20, au fost scăzute atunci când celulele au fost crescute în condiții de cultură sferoidă și au crescut semnificativ după atașare. Acest lucru sugerează că celulele P6C ​​din sferoizi păstrează o stare nediferențiată și suferă un anumit grad de diferențiere pe măsură ce condițiile culturale se schimbă (Figura 1D). Comparativ cu linia celulară P6C, linia celulară diferențiată de carcinom colorectal SW480 a prezentat expresie CD44 scăzută, expresie CK20 ridicată și a fost pozitivă pentru expresia CDX2 (Figura 1D).

Formarea clonală îmbunătățită este una dintre caracteristicile CSC. Când 100 de celule au fost implantate pe o placă cu 6 godeuri, am observat că s-au generat mai multe clone din linia celulară P6C decât din liniile celulare HCT116 și SW480; această diferență în numărul de clone a fost semnificativă (Figura 1E). Aceste date sugerează că linia celulară P6C este capabilă să sufere auto-reînnoire și diferențiere, ambele caracteristici ale celulelor stem.

Celulele P6C ​​exprimă gene de tulpină

Expresia genei stem în celulele P6C. (A) Imunofluorescența proteinelor stem în celulele P6C ​​cultivate. Sferele P6C ​​au fost disociate, însămânțate pe lamele de acoperire și lăsate timp de 3 ore. După fixarea celulelor cu paraformaldehidă, celulele au fost incubate cu anticorpii indicați. DAPI a fost folosit pentru a pata contoare nucleare. Scală, 100 μm. (B) Expresia genei tulpinilor detectată prin Western blot. Celulele P6C ​​au fost transfectate stabil cu constructul pOct3/4 promotor-EGFP (OPG). Întregul lizat celular al celulelor HT29, HCT116, SW480, P6C și P6C-OPG a fost aplicat uniform, supus SDS-PAGE și transferat pe membranele de nitroceluloză. Membranele au fost apoi incubate cu anticorpii indicați și vizualizate utilizând sistemul ECL. (C) Efectul shRNA CD44 asupra expresiei Oct3/4 în celulele P6C. Activitatea relativă a promotorului Oct3/4 a fost măsurată prin intensitatea fluorescenței GFP așa cum a fost detectată prin citometrie în flux. P6C și celulele parentale au fost utilizate ca martori. Fiecare probă a fost efectuată în trei exemplare și experimentul a fost repetat de trei ori. b P

Divizarea simetrică și asimetrică a celulelor P6C. (A) Activarea promotorului Oct3/4 în celulele P6C ​​și SW480. Celulele P6C ​​și SW480 au fost transfectate stabil cu constructorul pOct3/4 promotor-EGFP. Activarea promotorului Oct3/4 și expresia CD45 au fost măsurate prin intensitatea fluorescenței folosind un citometru de flux. (B) Autoînnoirea celulei P6C pozitive Oct6/4. O celulă P6C Oct3/4 pozitivă a fost însămânțată într-o placă cu 6 godeuri și observată la microscop. Fotografiile au fost făcute la fiecare 24 de ore pentru a detecta formarea holocenului. Scală, 50 μm. (C) Diviziune asimetrică a unei celule P6C ​​Oct3/4 pozitive. O meroclonă dintr-o celulă P6C Oct3/4 pozitivă a suferit o diviziune asimetrică în celulele din stadiul 2. Fotografiile au fost făcute la fiecare 24 de ore. Scală, 50 μm. (D) Meroclon, paraclon și holocloni diferiți derivați din celule pozitive Oct3/4. Morfologia celulară în clona parțială pozitivă Oct3/4 (de sus) a arătat aderența strânsă a celulelor Oct3/4 pozitive și o interacțiune relaxată de Oct3/4-negativă celule. Două clone una lângă cealaltă indicând faptul că paraclonul este Oct3/4-negativ și holoclona este Oct3/4-pozitiv (jos). Scală, 200 μm.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Auto-asamblarea și diferențierea sunt trăsături caracteristice ale celulelor stem. Pentru a înțelege rolurile lor în linia celulară P6C, am implantat celule individuale P6C-OPG într-o placă cu 96 de godeuri și am observat divizarea lor la microscop. Majoritatea celulelor canceroase oct3/4-pozitive au suferit o divizare simetrică pentru a forma celule holoclon-GFP pozitive (87%), așa cum se arată în Figura 3B, în timp ce doar 13% din celulele P6C ​​au generat mercloni prin diviziune asimetrică (Figura 3C). Procent mic (

0,5%) din celule Oct3/4-negative s-au putut diversifica în celule Oct3/4-pozitive atunci când au fost însămânțate în vase ultra-subțiri (datele nu sunt prezentate). De asemenea, am observat că expresia Oct3/4 a fost puternic corelată cu morfologia celulară. Toate paraclonii au fost negativi cu Oct3/4, în timp ce toți holoclonii observați au constat din celule Oct3/4-pozitive. În meroclonă, celulele care exprimă Oct3/4 au fost ferm aderate, în timp ce celulele negative pentru Oct3/4 au fost liber contactate așa cum s-a observat la un microscop cu contrast de fază (Figura 3D). Aceste observații susțin în continuare ipoteza că celulele P6C ​​au proprietăți critice de auto-reînnoire și diferențiere. În plus, Oct3/4 poate fi un marker al CSC colorectal care au un potențial mai mare de a suferi o diviziune simetrică decât s-a sugerat anterior 16 .

Instabilitate cromozomială și mutații în p53 în celulele P6C

Una dintre caracteristicile cheie ale celulelor canceroase versus celulele normale este instabilitatea cromozomială, care este considerată critică pentru inițierea tumorigenezei 17; cu toate acestea, rolul exact pe care îl joacă instabilitatea genomică în inițierea CSC rămâne evaziv. Prin urmare, am fost interesați să investigăm integritatea genomică a liniei celulare P6C. Așa cum se arată în Figura 4A, 73% din celulele P6C ​​au avut 59 de cromozomi. A existat o copie a cromozomilor 3, 4, 9, 13, 14 și 15 și trei copii ale cromozomilor 7, 12, 20 și 22. Translocațiile cromozomiale au fost, de asemenea, frecvente în această linie celulară, împreună cu inserțiile și delețiile cromozomiale (Figura 4A). Aceste date indică faptul că linia celulară P6C suferă de instabilitate cromozomială și mitoză anormală, care sunt caracteristici comune ale celulelor canceroase.

Cariotip și mutații ale celulelor p53 P6C. (A) cariotip reprezentativ al celulelor P6C. Aproximativ 73% din celulele P6C ​​au avut 59 de cromozomi. Fiecare cromozom a fost colorat cu o culoare diferită prin analiza FISH. (B) 72P la 72R mutație în alela p53 a celulelor P6C (pasajul 120). ADNc p53 a fost transcris invers din ARNm și clonat într-un vector cu lumină T înainte de secvențiere (sus). Mutația C la G a fost confirmată de Chromos Map (jos). (C) Inserarea a 117 pb în ADNc p53 din celulele P6C, rezultând un codon de oprire prematur "TGA" după 25 de aminoacizi. (D) alele p53 din pasajul 4 și pasajul 120 al celulelor P6C. CDNA a fost transcris invers din ARNm și gena p53 a fost amplificată prin PCR înainte de inserarea în vectorul T. Analiza statistică a alelelor p53 a fost efectuată prin secvențierea a 10 până la 22 de constructe din fiecare probă.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Mutația genetică a genelor supresoare tumorale, cum ar fi p53, este strâns asociată cu inițierea cancerului. Ne-am întrebat dacă CSC au avut o genă p53 mutantă, care ar putea fi legată de proliferarea lor anormală. Gena p53 a fost donată din linia celulară P6C și analiza secvenței a arătat că mutanții 72P la R au apărut în 60% și 67% din pasajul 4 și 120 celule (Figura 4B, 4D). De asemenea, am găsit o inserție de 117 pb în ADNc p53; această inserție a dus la o trunchiere de 25 de aminoacizi la capătul N-terminal al p53 (Figura 4C). Important, am constatat că mutațiile genei p53 au fost similare atât în ​​celulele cu pasaj scăzut (pasajul 4), cât și în celulele cu pasaj înalt (pasajul 120), sugerând cu tărie că aceste mutații nu s-au acumulat din cauza condițiilor de cultură celulară in vitro (Figura 4D ). ). Aceste date susțin, de asemenea, posibilitatea ca mutațiile din anumite celule stem să ducă la apariția CSC, așa cum sa sugerat deja.

De asemenea, am determinat rata de proliferare a celulelor P6C în cultura monostrat prin calcularea ratei de creștere a celulelor. Așa cum se arată în Figura Adițională 5, timpul de dublare al celulelor P6C a fost

20 de ore, similar cu liniile celulare SW480 și HCT116 (P> 0,05). Aceste date sugerează că celulele P6C ​​au proprietăți proliferative similare cu linii celulare diferențiate de cancer colorectal atunci când sunt cultivate în vase de cultură celulară.

Tumoră xenogrefă holoconică derivată dintr-o singură celulă

Am abordat în continuare întrebarea dacă o singură celulă P6C ar putea duce la o tumoră xenogrefă, care este un semn distinctiv al CSC. Șoarecii goi au fost injectați cu holocloni cu o singură celulă care conțin aproximativ 500 de celule. În mod surprinzător, tumorile cu xenogrefă au început cu o incidență de 100% (6/6). Apoi am disociat și tumorile tripsinizate de la șoareci goi pentru a regenera clone secundare derivate din celule individuale. Injecția repetată de clone secundare, aproximativ 500 de celule, la șoareci goi a dus, de asemenea, la o incidență de 100% a inițierii tumorii. Aceste date susțin, de asemenea, noțiunea că celulele P6C ​​au capacitatea de auto-reînnoire și diferențiere in vivo .

Unul dintre avantajele liniei CSC este furnizarea unui sistem ideal pentru monitorizarea progresiei tumorii in vivo. Pentru această strategie, am pre-etichetat celulele P6C-OPG cu celule dublu pozitive DsRed și purificate prin FACS (Figura 5A). Holoclonii dublu pozitivi DsRed/GFP au fost selectați și transplantați la șoareci goi (Figura 5B). Dezvoltarea tumorii a fost vizualizată prin imagistica cu fluorescență a întregului corp, așa cum se arată în Figura 5C. Imunohistochimia GFP a relevat că anumite celule P6C ​​Oct6/4-pozitive s-au diferențiat în celule Oct3/4-negative în tumorile xenogrefă. Co-localizarea CD44 și Oct3/4 a fost detectată prin colorarea secțiunilor seriale. Interesant este că celulele duble pozitive CD44 și Oct3/4 au fost localizate în clustere în tumorile xenogrefă similare cu cancerele primare (Figura 5D).

Imagistica tumorilor derivate dintr-o singură clonă de celule P6C. (A) Celulele P6C-OPG marcate cu DsRed au fost sortate după FACS. Celulele P6C-OPG au fost transfectate cu constructul DsRed și analizate de FACS. Celulele dublu pozitive GFP/DsRed au fost separate pentru propagare în vase de cultură. (B) Clone dublu pozitive GFP/DsRed. DsRed a fost exprimat stabil într-o celulă derivată din clona P6C-OPG. Scală, 200 μm. (C) Tumori xenogrefă inițiate din holoclonii P6C-OPG marcați cu DsRed la șoareci nud. Tumorile au fost detectate prin imagistica cu fluorescență a întregului corp (FX PRO in-vivo, Carestream) și au prezentat intensitatea relativă a fluorescenței la d 0 și 30. (D) Imunohistochimia tumorilor cu xenogrefă. Tumorile au fost fixate în parafină și CD44 și s-au folosit anticorpi GFP pentru a detecta expresia CD44 și Oct3/4. Scală, 200 μm.

Imagine la dimensiune completă

  • Descărcați un diapozitiv PowerPoint

Rezistența la medicamente a celulelor P6C

S-a sugerat că CSC-urile sunt capabile să confere rezistență la medicamente și să contribuie la reapariția cancerului. Prin urmare, am căutat să abordăm întrebarea dacă P6C au fost rezistente la agenții chimioterapeutici. Camptotecina (CPT) și 5-fluorouracil (5-FU) sunt chimioterapice utilizate în mod obișnuit în tratamentul cancerului colorectal. Comparativ cu celulele HCT116 și SW480, am constatat că celulele P6C ​​au fost mai puțin sensibile la CPT și 5-FU (Figura 6A, 6B; Figura suplimentară 6A). În plus față de absența inhibării proliferării celulare, celulele P6C ​​au fost extrem de rezistente la apoptoza indusă de 5-FU, așa cum se arată prin colorarea anexinei V/PI (Figura 6B, 6C; Figura suplimentară 6B). Deoarece cele mai frecvent utilizate chimioterapice funcționează prin oprirea ciclului celular, am investigat dacă 5-FU a afectat ciclul celular. Spre surprinderea noastră, celulele P6C ​​au fost mai puțin sensibile la punctul de control S-G2 indus de 5-FU comparativ cu celulele SW480 comparativ cu celulele SW480. Deși oprirea ciclului celular a continuat timp de 48 de ore, acest efect a fost atenuat timp de 72 de ore (Figura 6D). Aceste date sugerează că există un punct de control unic al ciclului celular în CSC, ceea ce duce la rezistența la medicamente.

Chimiorezistența celulelor P6C. (A) Observarea morfologică a celulelor P6C, HCT116 și SW480 tratate cu 2 μmol/l camptotecină. Morfologia celulară a fost observată la microscop după 24 și 48 de ore. Scală, 100 μm. (B) 5-FU a indus moartea celulară a celulelor P6C și SW480. Celulele au fost tratate cu 1 ug/ml 5-FU pentru timpii indicați și apoi tripsinizate. După colorare cu anexina V și PI, s-a efectuat analiza citometrică în flux. (C) Analiza statistică a morții celulare induse de 5-FU. Celulele P6C ​​și SW480 au fost tratate cu 0, 1, 1 și 10 μg/ml 5-FU la orele indicate. Moartea celulară a fost calculată ca procent de celule PI + determinate prin citometrie în flux. Acest experiment a fost repetat de trei ori. c P 18, 19, 20. Un raport anterior a arătat, de asemenea, că exprimarea incorectă a genei OCT4 a dus la displazie intestinală semnificativă 21. În al treilea rând, am demonstrat că mărgelele sau holoclonii obținuți dintr-o singură celulă au dus la o incidență de 100% a tumorii xenogrefei la șoareci goi. În cele din urmă și important, am arătat că P6C-urile ar putea suferi auto-reînnoire și diferențiere. Ambele funcții sunt cruciale pentru progresia CSC către tumoră.

Contribuția autorului

Guan-hua RAO a efectuat teste imunologice și a participat la crearea unei linii celulare cu ajutorul Xiao-hui WANG, Jun WANG și Hai-jing JIN; Hong-min LIU a efectuat studii celulare, a participat la cultura celulară și a pregătit un manuscris; Bao-wei LI și Yan-lei YANG au prelevat probe tumorale, au efectuat studii de tumorigenicitate; Jia-jie HAO și Ming-rong WANG au efectuat studii genetice; Quan CHEN a proiectat experimentele și a elaborat manuscrisul; și Lei DU au efectuat studii moleculare și analize statistice, au participat la proiectarea experimentală și au pregătit un manuscris.

Informatii suplimentare

Fișiere imagine

Imagine suplimentară S1

Controale ale anticorpilor anti-CD45, anti-CD31 și anti-CD24.