PORUBČANOVÁ, V. Conținutul substanțelor biologic active selectate în zahărul Stevia. Brno: Universitatea de Tehnologie Brno, Facultatea de Chimie, 2013. 47 p. Conducător de teză RNDr. Dr. Milena Vespalcová . DECLARAȚIE Declar că am pregătit teza de licență în mod independent și că am citat corect și complet toate sursele literare folosite. În ceea ce privește conținutul, teza de licență este proprietatea Facultății de Chimie, Universitatea de Tehnologie din Brno și poate fi utilizată în scopuri comerciale numai cu acordul conducătorului tezei de licență și al decanului FCH BUT. semnătura studentului MULȚUMIRI Aș dori să mulțumesc conducătorului meu RNDr. Dr. Milena Vespalcova pentru a permite elaborarea unui subiect care mă interesează, dar și pentru îndrumare profesională, consultații și timpul pe care mi l-a acordat de-a lungul lucrării. 4
4.1 Determinarea conținutului fenolic total în funcție de timp. 30 4.2 Determinarea conținutului fenolic total în funcție de temperatura apei. 30 4.3 Determinarea conținutului fenolic total după o perioadă mai lungă de levigare. 31 4.4 Determinarea substanțelor fenolice din extracte din diferite probe. 32 5 CONCLUZIE. 34 6 LISTA SURSELOR UTILIZATE. 35 7 LISTA ABREVIERILOR UTILIZATE. 38 8 LISTA ANEXELOR. 39 9 ANEXE. 40 6
Structura de bază a steviolului Tabelul 7: Structura și dulceața glicozidelor din stevia [4,6,7] Compusul R1 R2 Formula de sinteză Dulceață Steviol HHC 20 H 30 O 3 Biozid de Steviol H β-glu-β-glu (2 1) C 38 H 60 O 18 100 125 Stevioside β-glu β-glu-β-glu (2 1) C 32 H 50 O 13 250 300 Rebaudiosid A β-glu β-glu-β-glu (2 1) C 44 H 70 O 23 350 450 β-glu (3 1) Rebaudioside BH β-glu-β-glu (2 1) C 38 H 60 O 18 300 350 β-glu (3 1) Rebaudioside C β-glu β-glu-α-ram ( 2 1)) C 44 H 70 O 2 50 120 β-glu (3 1) Rebaudiosid D β-glu-β-glu (2 1) β-glu-β-glu (2 1) C 50 H 80 O 28 200 300 β- glu (3 1) Rebaudioside E β-glu-β-glu (2 1) β-glu-β-glu (2 1) C 44 H 70 O 23 250 300 Rebaudioside F β-glu β-glu-β -xil (2 1) C 43 H 68 O 22 β-glu (3 1) Dulcosid A β-glu β-glu-α-ram (2 1) C 38 H 60 O 17 100 125 Explicații: Glu glucoză, Ram ramoză, Xil xiloză Părțile plantei, altele decât rădăcina, au un gust dulce, dar conținutul de glicozide diterpenice din ele nu este același. Acestea se găsesc în cea mai mare parte în frunze, datorită cărora această parte a plantei este utilizată în principal pentru producerea de extracte. 14
Figura 5: Structura flavanului [14] Acizi fenolici Structura acestor acizi constă dintr-un nucleu benzenic de care sunt atașate grupările hidroxil și carboxil. [9] Acid cafeic Formula sa generală este C 9 H 8 O 4 și denumirea sistematică este acid 3,4-dihidroxifenilprop-3-enoic. Este unul dintre derivații hidroxi ai acidului cinamic. [9] Acid clorogenic Este un ester al acidului cafeic cu denumirea sistematică de acid 3 - [(3,4-dihidroxicinamoil) oxi] -1,4,5-trihidroxiciclohexan-1-carboxilic. Formula sa generală este C 16 H 18 O 9. [9] Alte substanțe fenolice din stevia Pe lângă fenoli și polifenoli deja menționați, stevia lasă quercetină, epicatechină, avicularulară, guayaverină, quercitrin, apigenin-4-O-glucozidă, luteolină - 7-oglucozid, quercetin-3-o-glucozid, camfor-3-o-ramnosid și centaureidină metoxilată. [9,14] 2.2.8 Sterebinele și alți compuși chimici Sterebinele aparțin grupului de bisnorditerpenoizi, a căror structură și proprietăți fizico-chimice de bază au fost descrise de Oshima și colegii săi în 1986 și 1988. Serebinele A-H se găsesc în stevia. 17
Figura 6: Formule structurale ale sterebinelor AH [9] Alte substanțe identificate în stevia dulce sunt: sigmasterol, β-sitosterol, β-amirină acetat, austroinulină, 6-O-acetilustroinulină, 7-O-acetilustroinulină, triesteri de lupeol, pigmenți, vegetale gume, componente uleioase volatile și substanțe anorganice. [9,15] 2.3 Efectul steviei asupra sănătății umane Diverse studii științifice confirmă efectele benefice ale steviei asupra sănătății umane. În unele cazuri, poate atenua sau chiar trata unele probleme de sănătate. Glicozidele Steviol sunt un adaptogen natural, ajutând astfel organismul să se adapteze la condiții de mediu nepotrivite, precum radiații, metale grele și compuși toxici. Aceste proprietăți au fost folosite pentru prima dată în Japonia după aruncarea a 2 bombe atomice și pentru a doua oară după explozia unei centrale nucleare din Ucraina. [16] 18
temperatura de 120 ° C. Creșterea suplimentară a temperaturii a început să descompună steviosidul până când a fost complet descompus la 200 ° C. [19] Figura 7: Graficul dependenței descompunerii steviosidelor de temperatură [19] 2.4.2 Stabilitatea îndulcitorului la pH și temperatură diferite O soluție apoasă de steviosid cu o concentrație de 0,5 gl -1 a fost testată la o temperatură de 60 și 80 C timp de 1 până la 2 ore în intervalul de ph 1-10. Steviosidul într-o soluție apoasă cu un pH de 2-10 temperat la 60 ° C timp de 2 ore practic nu se descompune. După ridicarea temperaturii la 80 ° C, 5% din steviosid se descompune la pH 2 și 10. Într-un mediu foarte acid (ph 1), steviosidul se degradează rapid la complet atunci când este incubat la 80 ° C timp de 2 ore. Produsele de degradare rezultate sunt steviolbiosidă și glucoză deoarece scindarea are loc la legătura ester C19 a steviosidei. [8] Figura 8: Cantitatea de steviosid la pH, temperatură și timp diferit [19] 22
3.3.5 Determinarea conținutului fenolic total Fiecare determinare a extractelor individuale a fost efectuată în trei tuburi în care au fost pipetate 6 ml de apă, 0,5 ml de reactiv Folin-Ciocalteu și 0,1 ml de extract corespunzător. Conținutul tuburilor a fost lăsat să stea timp de 5 minute după amestecare. Ulterior, s-au adăugat 1,5 ml soluție de carbonat de sodiu 20% și soluțiile au fost agitate. După 2 ore, sa măsurat absorbanța la 765 nm. [13] 29
4 REZULTATE ȘI DISCUȚII Metoda descrisă la articolul [13] a fost utilizată pentru a determina conținutul total de substanțe fenolice din extracte de frunze dulci de stevia. 4.1 Determinarea conținutului total de substanțe fenolice în funcție de timp Pentru această determinare, extrasul nr. 1. Concentrația substanțelor fenolice este exprimată în echivalent acid galic în mg per g de frunze de stevia. Tabelul 9: Rezultatele determinării substanțelor fenolice în funcție de timp t [min] 5 10 15 20 25 30 35 40 c 1 [mg g -1] 271,07 327,56 406,36 464,93 471,21 479,58 477, 79 480,97 Graficul 1: Cantitatea de fenolici în funcție de timp Conținutul de fenolici din extractul din frunzele de stevia a crescut în decurs de 20 de minute de levigare. După acest timp, cantitatea de substanțe fenolice nu a crescut semnificativ. Prin urmare, 20 de minute au fost utilizate ca timp standard de extracție în alte teste. 4.2 Determinarea conținutului total de substanțe fenolice în funcție de temperatura apei Extract nr. 2 (frunze mărunțite mărunt) și extragerea nr. 3 (frunze zdrobite în pulbere). 30
Tabelul 10: Rezultatele determinării conținutului de substanță fenolică în funcție de temperatura temperaturii apei [C] 10 23 40 60 80 100 c 2 [mg g -1] 467,72 510,96 566,75 638,57 655,31 654,61 c 3 [mg g -1] 488,64 622,61 672,77 754,51 755,38 783,20 Graficul 2: Cantitatea de substanțe fenolice în funcție de temperatura apei Conținutul de substanțe fenolice din extractul de frunze de stevia a crescut odată cu creșterea temperaturii apei în care au fost extrase frunzele. Cu o temperatură a apei mai mare de 60 C, conținutul de substanță fenolică nu a crescut semnificativ, prin urmare temperatura ideală a apei pentru extracție poate fi considerată ca fiind de 60 C. Prin levigarea frunzelor zdrobite în pulbere, mai multe substanțe fenolice sunt eliberate în extract, dar datorită la o schimbare mai semnificativă a gustului este recomandat pentru ceai.utilizați frunze doar mărunțite. 4.3 Determinarea conținutului total de substanțe fenolice după o perioadă mai lungă de levigare Pentru această determinare, extractele nr. 4 și 5. Testul a fost, de asemenea, efectuat de 2 ori, pentru a verifica acuratețea rezultatelor. Tabelul 11: Rezultatele determinării conținutului de substanță fenolică după o perioadă mai lungă de timp de lixiviere [C] 10 23 40 60 80 100 c 4 [mg g -1] 467,72 510,96 566,75 638,57 655,31 654,61 c 5 [mg g -1] 488,64 622,61 672,77 754,51 755,38 783,20 31
Graficul 3: Cantitatea de fenolici în funcție de timpul prelungit de extracție Timp de 2,5 ore, a existat inițial o ușoară, dar în timp, o creștere semnificativă a conținutului de fenolici din extract în timpul levigării. Conținutul maxim posibil al acestor substanțe determinate a fost atins imediat după 2,5 ore de levigare. Acest fenomen pare a fi legat de faptul că unele substanțe fenolice, cum ar fi epicatechin, gallocatechin gallate și epicatechin gallate, sunt extrase numai după o lungă perioadă de timp. Reducerea ulterioară a cantității de analiți s-a datorat oxidării și descompunerii substanțelor fenolice [25]. Frunzele au fost zdrobite în mâini, astfel încât părțile zdrobite nu aveau aceeași dimensiune. În extrasul nr. 4 au existat fragmente mai mici, care s-au manifestat ca un conținut mai mare de substanțe fenolice în acest extract. 4.4 Determinarea substanțelor fenolice din extracte din diferite probe Pentru extracție s-au utilizat probe de frunze uscate de stevia din 2010, 2012 și frunze proaspete (extracte nr. 6-9). Procedura de preparare a extractelor este descrisă în capitolul 3.3.4. Tabelul 12: Rezultatele determinării substanțelor fenolice din extracte din diferite probe extract nr. 6 7 8 9 c [mg g -1] 469,12 367,30 45,83 6,77 32
Graficul 4: Cantitatea de substanțe fenolice din extracte din diferite probe În extrasele nr. 8 și 9 (frunze proaspete) au fost mult mai puține substanțe fenolice decât în extractele de frunze uscate. Principalul motiv este că 70-90% din greutatea frunzelor proaspete este apă. Prin ruperea frunzelor proaspete în bucăți mici, peretele celular doar al unor celule este deteriorat, astfel încât nu toate substanțele fenolice sunt eliberate în extract. Congelarea a provocat daune mai eficiente pereților celulari, prin urmare extractul nr. 8 conțineau mai multe substanțe de testat. Conținutul de substanțe fenolice din plante diferă deoarece depinde nu numai de tipul de plantă, ci și de metoda de cultivare a acesteia. 33
7 LISTA ABREVIERILOR UTILIZATE A - Absorbanță FAO (organizație pentru alimentație și agricultură) - Organizație pentru alimentație și agricultură hm. - JECFA (Comitetul mixt FAO/OMS de experți în aditivi alimentari) - JECFA (Comitetul mixt FAO/OMS de experți în aditivi alimentari). - ARN colectiv (acid ribonucleic) - acid ribonucleic SUA (Statele Unite ale Americii) - UV din SUA (radiații ultraviolete) - radiații ultraviolete VIS (radiații vizibile) - lumină vizibilă OMS (Organizația Mondială a Sănătății) - Organizația Mondială a Sănătății 38
8 LISTA ANEXELOR Anexa nr. 1: Grafic Dependența de calibrare a acidului galic Anexa nr. 2: Unele produse alimentare cu stevia Anexa nr. 3: Glicozide Steviol sub formă de îndulcitor de masă Anexa 4: Aditivi alimentari aprobați și condiții de utilizare a acestora în categoriile alimentare 39
9 ANEXE Anexa nr. 1: Grafic Dependența de calibrare a acidului galic c [mg l -1] A 50 0,086 100 0,133 150 0,223 300 0,441 450 0,651 650 0,936 40
Anexa 2: Anumite produse alimentare cu stevia [26,27] 41
Anexa nr. 3: Glicozide Steviol sub formă de îndulcitor de masă 42