imunoproteasomă

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Șoarecii cu deficit de LMP7 sunt rezistenți la obezitatea indusă de HFD
  • Șoarecii cu deficit de LMP7 sunt rezistenți la tulburările metabolice induse de HFD
  • Deficitul de LMP7 nu are niciun efect asupra consumului de alimente, asupra activității locomotorii și asupra cheltuielilor de energie
  • Deficitul de LMP7 reduce absorbția lipidelor
  • LMP7 în celulele măduvei osoase și non-măduvei osoase contribuie la dezvoltarea obezității
  • Deficitul de LMP7 ameliorează răspunsurile inflamatorii în țesutul adipos
  • discuţie
  • metode
  • fiară
  • Analiza micro-CT
  • Test biochimic
  • GTT și ITT
  • Histologie și imunohistochimie
  • Analiza RT-PCR în timp real
  • Experimente BMT
  • Analiza gazelor respiratorii și a aparatului locomotor
  • Colectarea fecală și extragerea lipidelor fecale
  • Analiza citometriei de flux
  • Experimente in vitro
  • analize statistice
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Comentarii

obiecte

  • Sistemul endocrin și bolile metabolice
  • Sindromul metabolic
  • Obezitatea

abstract

Obezitatea este un factor de risc major pentru rezistența la insulină, hiperglicemie, dislipidemie și hipertensiune arterială, cunoscut sub numele de sindrom metabolic, și a devenit o problemă globală de sănătate publică. Aceste tulburări metabolice cresc riscul bolilor cardiovasculare și al diabetului zaharat de tip 2 și contribuie la creșterea mortalității și morbidității. Deși patogeneza obezității este complexă și implică diverși factori, studii recente au arătat că inflamația în țesutul adipos este un jucător patogen cheie 1, 2. De fapt, infiltrarea macrofagelor în țesutul adipos este observată la modelele animale de obezitate, precum și la subiecții umani obezi cu sindrom metabolic. Aceste celule sunt o sursă majoră de producere a citokinelor/chemokinelor inflamatorii, incluzând factorul de necroză tumorală α (TNF-α), interleukina (IL) -1β și ligandul 2 al chemokinei cu motiv CC (CCL2), cunoscut și sub numele de proteina-1 chimiotratantă a monocitelor [ MCP-1].), Care la rândul său câștigă celule inflamatorii și promovează în continuare inflamația țesutului adipos. Cu toate acestea, nu este încă pe deplin clar modul în care apare inflamația și care este reglementat în fiziopatologia obezității.

Rezultatul

Șoarecii cu deficit de LMP7 sunt rezistenți la obezitatea indusă de HFD

Am examinat mai întâi dacă deficitul de LMP7 ar putea afecta dezvoltarea obezității la șoarecii de tip sălbatic (WT) și șoarecii LMP7 -/- hrăniți cu o dietă normală sau HFD timp de 8 săptămâni. Deși nu a existat nicio diferență semnificativă în creșterea în greutate corporală între șoarecii WT și LMP7 -/- pe o dietă normală, șoarecii LMP7 -/- au câștigat în mod semnificativ mai puțină greutate corporală decât șoarecii WT pe o dietă bogată în grăsimi (HFD) (Fig. 1A Greutatea țesutului adipos alb epididimal și subcutanat (WAT) a fost redusă dramatic la șoarecii LMP7 -/- în comparație cu greutatea la șoarecii WT (Fig. 1B). Greutatea relativă (greutatea țesutului/greutatea corporală) a fiecărui WAT la șoarecii LMP7 -/- a fost mai mică decât la șoarecii WT (Fig. 1C, ficat: reducere de 15,9%, epididimal: 44,7%, mezenteric: 24,9%, perirenal: 50,7 % și subcutanat: 47,3%). Scăderea a fost atribuită histologic dimensiunii reduse a adipocitelor în WAT epididim și subcutanat (Fig. 1D, E). Analiza tomografiei computerizate (CT) a arătat greutăți viscerale și subcutanate mai mici ale grăsimii la șoareci LMP7 -/- decât la șoareci WT (Fig. 1F, G). Aceste constatări sugerează că deficitul de LMP7 este protejat împotriva obezității induse de HFD.

( A - C ) TCHO seric, niveluri TG ( A ), glucoza din sange ( B ) și insulină serică ( C ) la WT și LMP7 -/- șoareci cu o dietă normală și HFD (n = 8-12). ( D, E ) Rezultate GTT ( D ) și ITT ( E ) la WT și LMP7 -/- șoareci cu o dietă normală și HFD (n = 8 pentru fiecare). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. * p -/- fie pe o dietă normală, fie pe HFD (Fig. 3A), am măsurat activitatea locomotorie și cheltuielile de energie în ambele tulpini pentru a evalua diferențele în ratele metabolice bazale. Nu s-au găsit diferențe semnificative în activitatea locomotorie, consumul de oxigen (VO 2), rata de schimb respiratorie (RER), consumul de carbohidrați (CH) și consumul de grăsimi (FAT) între șoarecii WT și LMP7 -/- pe o dietă normală sau o dietă HFD. . (Fig. 3B, C). Pentru a susține acest rezultat, deși expresia Ucp1 (proteina 1 care nu splicing sau termogenină) a fost crescută în țesutul adipos maro prin hrănirea HFD, nu a existat nicio diferență semnificativă în expresie între șoarecii WT și LMP7 -/- (datele nu sunt prezentate).

( A ) Aportul alimentar la șoareci WT și LMP7 -/- pe o dietă normală (n = 7-8) și HFD (n = 13-14). ( B ) Activitate locomotorie la șoareci WT și LMP7 -/- pe o dietă normală și HFD (n = 8 pentru fiecare). C. Date privind cheltuielile de energie. VO 2, RER, CH și FAT la șoareci WT și LMP7 -/- pe o dietă normală și HFD (n = 8 pentru fiecare). Datele sunt exprimate ca medie ± SEM.

Imagine la dimensiune completă

Deficitul de LMP7 reduce absorbția lipidelor

Pentru a examina efectul antiinflamator al deficitului de LMP7 în WAT, am evaluat în cele din urmă dacă adiponectina și leptina sunt implicate în acest proces. Nivelurile serice de adiponectină au fost semnificativ mai mari la șoarecii LMP7 -/- hrăniți cu HMPD comparativ cu șoarecii WT hrăniți cu HFD (Fig. 6G). În consecință, expresia Adipoq, care codifică adiponectina, a fost, de asemenea, reglementată în WAT epididimal al șoarecilor LMP7 -/- (Figura suplimentară S3). Factorii de transcripție codificați de Pparg (receptorul activat cu proliferatorul peroxizomului γ), Cebpa (CCAAT/proteina de legare a amplificatorului [C/EBP] -α) și Cebpb (C/EBP-β) sunt cunoscuți a fi inductibili prin expresia Adipoq 12, 13. Expresia tuturor acestor factori de transcripție a fost semnificativ crescută la șoarecii LMP7 -/- comparativ cu șoarecii WT (Figura suplimentară S3). Nivelurile serice de leptină au crescut semnificativ la șoarecii WT hrăniți cu HFD, iar aceste niveluri au fost semnificativ reduse la șoarecii LMP7 -/- hrăniți cu HFD (Fig. 6H). Aceste rezultate sugerează că adiponectina și leptina au fost implicate în ameliorarea inflamației țesutului adipos și a tulburărilor metabolice la LMP7 -/șoareci. - .

discuţie

Principalele constatări ale acestui studiu sunt următoarele: (1) deficitul de LMP7 a redus acumularea de grăsime indusă de HFD și a fost protejat împotriva obezității; (2) Deficitul de LMP7 a îmbunătățit intoleranța la glucoză și sensibilitatea la insulină și a îmbunătățit metabolismul lipidelor și glucozei (3) nu a existat nicio diferență în aportul alimentar, activitatea locomotorie și cheltuielile de energie între șoarecii WT și LMP7 -/-; (4) Deficitul de LMP7 a redus absorbția lipidelor; (5) Experimentele BMT au arătat că LMP7 atât în ​​celulele derivate din măduva osoasă, cât și în celulele derivate din măduva osoasă au contribuit la dezvoltarea obezității induse de HFD; (6) Deficitul de LMP a redus răspunsurile inflamatorii, cum ar fi infiltrarea macrofagelor și expresia chemokinelor, crescând în același timp producția de adiponecție. Rezultatele acestui studiu sugerează că LMP7 contribuie la răspunsuri inflamatorii în țesutul adipos pe macrofage și la dezvoltarea obezității și a tulburărilor metabolice. Din câte știm, acest studiu oferă primele dovezi că LMP7 joacă un rol major în dezvoltarea obezității și a tulburărilor metabolice.

Există dovezi din ce în ce mai mari care sugerează că inflamația joacă un rol important în dezvoltarea obezității și a tulburărilor metabolice. 1, 2. Deși există multe rapoarte care descriu rolul inflamației în procesul lor, nu este pe deplin clar cum apare inflamația și cum este reglementată. Deși se știe că imunoproteasomul joacă un rol esențial în prezentarea antigenului MHC clasa I, cercetări recente au arătat că LMP7 este necesar pentru producerea de citokine pro-inflamatorii precum TNF-α și IL-6 și pentru progresia experimentelor artrita și colita 5, 6. În acest studiu, am demonstrat că deficitul de LMP7 inhibă inflamația țesutului adipos, obezitatea și tulburările metabolice: acest lucru sugerează că inhibarea LMP7 are potențialul de a preveni și trata obezitatea și tulburările metabolice. Într-adevăr, mai multe studii experimentale indică faptul că inhibitorul selectiv al LMP7 ONX-0914 este extrem de eficient în tratamentul artritei și colitei experimentale 5, 6. Efectul acestui inhibitor LMP7 asupra obezității și tulburărilor metabolice trebuie, prin urmare, să fie investigat în studiile viitoare.

Am arătat că deficitul de LMP7 a scăzut expresia lipazelor pancreatice, a crescut conținutul de lipide în scaun și a inhibat creșterea nivelurilor plasmatice de TG după administrarea orală de ulei sau HFD. Pe de altă parte, nivelurile serice de glucoză și insulină la șoarecii LMP7 -/- nu au fost afectate de o dietă normală. Șoarecii LMP7 -/- au îmbunătățit intoleranța la glucoză și sensibilitatea la insulină. Astfel, LMP7 afectează funcția secretorie externă și internă a pancreasului și este implicat în digestie și homeostazie hormonală, care ar fi importantă în starea metabolică a șoarecilor.

În concluzie, am arătat în mod clar că deficitul de LMP7 inhibă inflamația indusă de macrofage în țesutul adipos și îmbunătățește dezvoltarea obezității și a tulburărilor metabolice la șoarecii hrăniți cu HFD. Pe baza constatărilor noastre, ipotezăm că deficitul de LMP7 inhibă inflamația țesutului adipos prin inhibarea inducției proinflamatorii de citokine în macrofage și adiponeculare produse de adipocite. Mai mult, LMP7 afectează funcția secretorie externă și internă a pancreasului. Acest studiu nu numai că demonstrează că LMP7 poate fi o potențială țintă terapeutică în prevenirea și tratamentul obezității și tulburărilor metabolice, dar oferă și noi perspective asupra mecanismului care stă la baza fiziopatologiei acestor tulburări.

metode

Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru Utilizarea și Îngrijirea Animalelor Experimentale din Manualul de animale al laboratorului Jichi Medical University și au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale Jichi Medical University. Șoarecii C57BL/6J WT au fost achiziționați de la Japan SLC, Inc. (Hamamatsu, Japonia). Șoarecii LMP7 -/- au fost descriși anterior 4. Șoarecii masculi (cu vârsta cuprinsă între 9 și 10 săptămâni) au fost hrăniți fie cu 60 kcal% HFD (Research Diets: D12492, Japan LSG, Tokyo), fie cu chow standard (CE-2; CLEA Japan Inc., Osaka). Fiecare șoarece a fost cântărit la fiecare 2 săptămâni. La punctele finale, șoarecii au fost posti timp de 6 ore, au fost cântăriți din nou și sângele a fost colectat pentru a obține ser. După perfuzie, țesuturile au fost excizate cu atenție și cântărite.

Analiza micro-CT

Analiza micro-CT a fost efectuată folosind un LaTheta LCT-200 (Hitachi Aloka Medical, Tokyo, Japonia). Masa de grăsime musculară, viscerală și subcutanată a fost analizată folosind software-ul LaTheta (Hitachi Aloka Medical).

Test biochimic

Sângele a fost colectat din vena cozii a 6 ore de șoareci la post. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate folosind un glucometru Terumo MEDISAFE® (Terumo Co., Tokyo, Japonia). Nivelurile serice sau plasmatice de TCHO și TG au fost măsurate utilizând sistemul FUJI DRI-CHEM (Fujifilm, Tokyo, Japonia). Nivelurile serice de insulină, adiponectină și leptină au fost măsurate folosind kituri ELISA (Sibayagi, Gunma, Japonia; R&D Systems Inc., Minneapolis, MN; și BioVendor R&D, Brno, Republica Cehă).

GTT și ITT

GTT a fost efectuat pe șoareci pe o dietă standard sau HFD timp de 8 săptămâni. Șoarecii au fost posti cu 6 ore înainte, cu acces gratuit la apă. Nivelurile de glucoză din sânge au fost apoi măsurate chiar înainte de injecția intraperitoneală de glucoză (1 g/kg greutate corporală în ser fiziologic) și 15, 30, 60, 90 și 120 de minute după administrare. ITT a fost efectuat în mod similar prin injectarea insulinei (0,75 U/kg greutate corporală) în loc de glucoză.

Histologie și imunohistochimie

Colorarea HE și imunohistochimia pentru F4/80 și LMP7 au fost efectuate așa cum a fost descris anterior în 4, 23 .

Analiza RT-PCR în timp real

ARN-ul total a fost preparat din rinichi folosind ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Toyama, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Analiza RT-PCR în timp real a fost efectuată utilizând un sistem de detectare a ciclului termic al cubului Takara TP960 PCR (Takara Bio Inc, Shiga, Japonia) pentru a detecta expresia ARNm așa cum a fost descris anterior 23. Expresia genică a fost normalizată prin expresia Actb (β-actină) utilizând software-ul furnizat împreună cu sistemul. Primerii utilizați pentru analiza RT-PCR sunt enumerați în tabelul suplimentar S1.

Experimente BMT

Șoarecii BMT au fost generați așa cum s-a descris anterior 24. Am folosit șoareci cu proteină fluorescentă verde (GFP) ca donatori pentru a verifica reconstituirea măduvei osoase după transplant cu acest protocol. Analiza de citometrie în flux a arătat că la 8 săptămâni după BMT, celulele sanguine periferice au constat în mai mult de 90% celule GFP-pozitive 24. Folosind acest protocol, am generat 3 tipuri de șoareci BMT: WT → WT, LMP7 -/- → WT, WT → LMP7 -/- șoareci).

Analiza gazelor respiratorii și a aparatului locomotor

Șoarecii au fost plasați individual într-o cameră metabolică timp de 48 de ore pentru a le permite să se adapteze la mediu și să obțină o rată de schimb respiratorie constantă (RER). Analiza gazelor respiratorii (O 2 și CO 2) a fost efectuată utilizând un sistem de analiză a gazelor metabolice cu circuit deschis conectat direct la un spectrometru de masă (Arco2000; ArcoSystem, Chiba, Japonia). Consumul de oxigen (VO 2) și producția de dioxid de carbon (VCO 2) au fost măsurate la fiecare 5 minute pentru fiecare cușcă (un șoarece). RER a fost calculat ca raport VCO2/V02. Consumul total de hidrocarburi (CH) și consumul de grăsimi (FAT) au fost calculate utilizând ecuațiile stoichiometrice Frayn după cum urmează: CH = 4,51 × VCO 2 - 3, 18 × V02 [mg/min] și FAT = 1,67 × (V02 - VCO) 2) [mg/min]. Activitatea locomotorie a fost determinată la fiecare 5 minute pentru fiecare cameră (un șoarece) de numărul de raze infraroșii sparte în direcțiile X și Y folosind un sistem de monitorizare a activității (ACTIMO-100; Shinfactory, Fukuoka, Japonia) combinat cu camere metabolice individuale.

Colectarea fecală și extragerea lipidelor fecale

Scaunele individuale de la șoareci alimentați cu HFD au fost recoltate timp de 24 de ore și uscate prin centrifugare în vid. Fecalele uscate au fost cântărite și zdrobite într-un mortar. Fecalele măcinate au fost transferate într-un tub de sticlă și cântărite din nou. Lipidele au fost extrase cu cloroform: metanol (2: 1) de două ori conform metodei Folch 25 și cântărite. Conținutul de lipide a fost calculat ca% în greutate fecale măcinate.

Analiza citometriei de flux

Leucocitele infiltrante în WAT epidimimal au fost analizate prin citometrie în flux așa cum s-a descris anterior 11. Datele de citometrie de flux au fost obținute folosind un FACSVerse (BD Biosciences, San Jose, CA) și analizate folosind software-ul FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA). Reactivii utilizați pentru analiza citometriei în flux sunt enumerați în tabelul suplimentar S2.

Experimente in vitro

Macrofagele peritoneale murine au fost cultivate în RPMI1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) și 1% antibiotic-antimicotic (Invitrogen, Carlsbad, CA) folosind plăci cu 24 de godeuri. După 48 de ore, celulele au fost stimulate cu 400 μM palmitat (10% BSA) 26 timp de 24 de ore. Nivelurile de IL-1β, IL-6 și TNF-α din supernatante au fost determinate folosind kituri ELISA (R&D Systems Inc.).

analize statistice

Rezultatele cu distribuție normală au fost analizate prin t-test parametric nepereche. Rezultatele fără distribuție normală au fost analizate prin testul Mann-Whitney, testul Kruskal-Wallis sau analiza longitudinală. Toate analizele au fost efectuate utilizând software-ul Stata, versiunea 13 (Stata Corp., College Station, TX). O valoare p a