obiecte
abstract
Timp de mulți ani, arheea a fost considerată fie metanogenă, fie extremofilă. Cu toate acestea, în ultimele decenii, subunitatea de ARN ribozomal mic (ARNr) și analiza genei 16S ARNr a probelor de mediu au relevat prezența arheilor în medii marine aerobe la temperaturi moderate (DeLong, 1992; Fuhrman și colab., 1992). Aceste arhee (aparținând în principal subdomeniului Crenarchaeota) au fost găsite în soluri (Birtrim și colab., 1997), mări polare (Murray și colab., 1998), estuare (Abreu și colab., 2001), peșteri (Gonzalez și colab ., 2006), o gamă largă de medii oceanice (DeLong și colab., 1994; Stein și Simon, 1996; Massana și colab., 1997; Massana și colab., 2000; Karner și colab., 2001), adâncime sedimente (Vetriani și colab., 1999; Teske și colab., 2002; Søresnson și Teske, 2006; Biddle și colab., 2008) și mlaștini sărate (Nelson și colab., 2009). Deși crenarchaeota este omniprezentă la nivel global și apare adesea într-o varietate de situații, se știu relativ puține despre abilitățile lor metabolice.
În acest raport, sunt prezentate experimente SIP care arată încorporarea 13C a diferitelor substraturi organice de către membrii Grupului Diverse Crenarchaeota (Inagaki și colab., 2003) și Grupul Marin I (Vetriani și colab., 2003). Rezultatele noastre demonstrează că crenarchaeota de mlaștină sărată este capabilă să asimileze o gamă largă de substraturi organice de carbon care sunt utilizate și de către populațiile bacteriene in situ, sugerând concurență între cele două domenii. În plus, există dovezi ale unei distribuții a resurselor pentru uree și proteine întregi. Interesant, a fost necesară o incubație minimă de 5 zile pentru a obține un semnal SIP clar pentru crenarchaea, indicând o dublare relativ lungă (2-2, 5 zile) a timpului comparativ cu comunitatea bacteriană. Aceste descoperiri sugerează că mecanismele de sus în jos și de jos în sus permit coexistența stabilă a crenariei și a bacteriilor în setările mlaștinii sărate.
Materiale și metode
Gel de agaroză cu 16 C ampliconi ai genei ARNr din 13 benzi C: a1) gol; a2) ADN lambda; a3) negativ; a4) transportator; a5) fără substrat; a6) 13 C-lipidă (2 mg ml-1); a7) 13 C-lipidă (10 mg ml-1); a8) 13-proteină C (2 mg ml-1); a9) 13-proteină C (10 mg ml-1); a10) 13 C-ISOGRO (2 mg ml-1); a11) 13 C-ISOGRO (10 mg ml-1); a12) control pozitiv; b1) ADN lambda; b2) negativ; b3) 13 C-purtător; b4) T0 (timp = 0; eșantion prelevat înainte de tratament); b5) fără substrat; b6) 12C-uree; b7) 13 C-uree; b8) 12C-bicarbonat; b9) 13 C-bicarbonat; b10) gol; b11) test de inhibare (pozitiv plus probă); b12) control pozitiv.
Imagine la dimensiune completă
Tabel în dimensiune completă
Incorporarea bacteriană a 13 C poate fi, de asemenea, detectată în experimentele SIP. Sinteza ADN-ului 13 C bacterian a fost observată la 83% din microcosmos, cu excepția concentrațiilor scăzute de uree și ISOGRO (Tabelul 2). Timpul relativ lung de incubație SIP (5 zile) a permis cel mai probabil generarea de bacterii încrucișate extinse (Gallagher și colab., 2005) și generarea 13 C-CO 2 (datele nu sunt prezentate). Incubarea cu 13 C-bicarbonat a fost, de asemenea, efectuată pentru a verifica dacă crenarchaea a preluat de fapt 13 CO 2 în loc de 13 C-substraturi marcate în timpul experimentului nostru SIP. Rezultatele sunt prezentate în Figura 1b. Tratamentul cu 13 C-bicarbonat nu a furnizat niciun amplicon crenarhian în banda 13 C (banda 1b-9). Testarea inhibitorilor PCR prin creșterea eșantionului pozitiv de ADN de 13C-ADN din incubația cu bicarbonat nu a indicat nicio supresie PCR din acest extract (banda 1b-11). Aceste rezultate demonstrează că semnalul cranarhian SIP este rezultatul încorporării substanțelor organice 13C, nu bicarbonatului marcat cu 13C, care a fost produs prin respirația bacteriană.
Tabel în dimensiune completă
Exemplu de profiluri TRFLP ale genelor de ARNr 16S crenarheal în benzile 12 C și 13 C din schimbarea lipidelor. Vârfurile evidențiate (gri) sunt afișate în biblioteca clonală.
Imagine la dimensiune completă
Compilarea amprentelor cernarheale cu TRF de la 85 la 169 bp ( A ) și 170-254 bp ( b ). Dimensiunile de vârf mari sunt indicate de casete (fixe, detectate în biblioteca de clone; punctate, nedetectate). Nuanțele deschise indică concentrații mai mari; nuanțele întunecate indică concentrații mai mici.
Imagine la dimensiune completă
Se determină estimarea filogenetică utilizând arborele de probabilitate maximă (PhyML) cu suport de la 100 bootstraps. Clonele din acest studiu sunt desemnate de numerele de acces TRF și GenBank. Punctele negre reprezintă secvențe găsite în sedimentele de coastă sau orale. Punctele deschise indică secvențe din biosfera mării adânci.
Imagine la dimensiune completă
discuţie
În acest raport, microcosmosii SIP au fost preparați folosind apă sterilizată cu filtru și incubația a fost încheiată după 5 zile. Crenarheotul de mlaștină sărată cu brânză sa dovedit a fi heterotrof, fără absorbție de 13C din bicarbonat pe parcursul experimentului. Anumite TRF crenarhice au fost detectate în fracția de 13 C din aproape fiecare microcosmos suplimentat cu 13 C-carbon organic, indiferent de tipul de substrat furnizat. Acest lucru sugerează că aceste crenaree specifice sunt capabile să asimileze o gamă largă de substraturi organice: intermediari metabolici simpli (acetat), aminoacizi (glicină), compuși organici de azot (uree), lipide și pigmenți și amestecuri complexe de biopolimeri (ISOGRO). Cu toate acestea, alte TRR crenarchaeal au fost detectate doar în 13 benzi C din microcoze modificate substrat (acetat sau uree) și pot avea abilități metabolice mai limitate.
Numărul total de TRF-uri în banda 12 C (linie) și în banda 13 C (bare gri) pentru vârfuri reprezentând mai mult de 2% din profilul comunității.
Imagine la dimensiune completă
Din timpul de incubație al experimentelor noastre SIP, este, de asemenea, posibil să se estimeze parametrii de creștere a crenarhiei in situ. Presupunând că sunt necesare două evenimente duplicate pentru marcarea completă a 13 C a ADN-ului și detectarea în banda noastră purtătoare de 13 C etichetată 100%, acest lucru sugerează că crenarchaea urinară salină are un timp de dublare în ordinea de 2 până la 2,5 zile. Studiile anterioare au măsurat rata de creștere a crenarchaea cultivate cu oxidarea amoniacului (Könneke și colab., 2005) și/sau au obținut timpi de dublare determinând numărul de copii al ARNr 16S (Park și colab., 2010). Aceste rapoarte arată rata maximă de creștere a arheilor oxidante de amoniac (AOA) în mediu lichid la 25-28 ° C între 0,57 și 0,78 pe zi (sau dublând între 1,28 și 1,75 zile). Dimpotrivă, constatările noastre sunt în concordanță cu observațiile anterioare privind o rată de creștere ușor mai lentă a sedimentelor (0, 2 pe zi, Mosier și colab. (2012)). Cu toate acestea, aceste rezultate pot fi o supraestimare a ratei potențiale de creștere, deoarece SIP necesită ca toate fragmentele precursoare pentru sinteza ADN să fie etichetate uniform cu 13C pentru a detecta.
În concluzie, multe Crenarchaea mezotermale (Thaumarchaea) din sedimentele mlaștinii sărate au asimilat o gamă largă de substraturi organice cu 13 C-substraturi pentru a-și replica genomul. Alte crenarchaea au fost mult mai selective în sursele de 13 C-carbon utilizate pentru creștere. Abordarea SIP demonstrează mlaștinile sărate care pot fi utilizate pentru a studia abilitățile metabolice ale crenarhiei și pot ajuta la determinarea condițiilor de laborator pentru izolarea acestor microorganisme heterotrofe. Odată ajuns în cultură pură, tehnicile microbiologice tradiționale pot fi folosite pentru a ne îmbunătăți înțelegerea abilităților fiziologice crenarheale. În cele din urmă, experimentele care leagă direct modelele de utilizare a carbonului cu membrii specifici ai comunității microbiene pot oferi informații despre relația competitivă dintre crenarhaia și bacterii și ne pot îmbunătăți înțelegerea ecologiei microbiene.