obiecte

abstract

Adiponectina joacă un rol cheie în reglarea homeostaziei energiei întregului corp prin modularea metabolismului glucozei și lipidelor. Deși reducerea expresiei adiponectinei indusă de obezitate este atribuită în primul rând eșecului reglementării transcripționale, mecanismele de bază sunt în mare parte nedefinite. Aici, am arătat că hipermetilarea ADN-ului unei anumite regiuni a promotorului adiponectinei suprimă expresia adiponectinei prin control epigenetic și ulterior exacerbează bolile metabolice la obezitate. Citokinele pro-inflamatorii induse de obezitate promovează expresia DNMT1 și activitatea enzimatică. DNMT1 activat selectiv metilează și stimulează o structură compactă a cromatinei în promotorul adiponectinei, care previne expresia adiponectinei. Suprimarea activității DNMT1 de către un inhibitor DNMT a dus la o îmbunătățire a intoleranței la glucoză indusă de obezitate și a rezistenței la insulină într-o manieră dependentă de adiponectină. Aceste descoperiri sugerează un rol critic pentru controlul epigenetic al genei adiponectinei de către DNMT1 în gestionarea homeostaziei energetice, sugerând că modularea activității DNMT1 reprezintă o nouă strategie pentru tratamentul bolilor legate de obezitate.

Reglarea epigenetică, inclusiv metilarea ADN-ului, este unul dintre mecanismele cheie pentru reglarea expresiei genelor eucariote fără modificarea secvenței ADN 1. Acumularea de dovezi a arătat că metilarea ADN va servi ca o punte între schimbările de mediu și răspunsurile celulare. În special, starea nutrițională modulează diferențial metilarea ADN-ului în mai multe gene metabolice, incluzând factorul nuclear hepatocitar 4α, homeoboxul 1 pancreatic și duodenal 1 (Pdx1), receptorul activat al proliferatorului peroxizomului (Ppar) și coactivaotr -1 α (Pgc-1 α) 2, 3 4, 5. Interesant este faptul că mai multe rapoarte au arătat că consumul de diete bogate în grăsimi (HFD) afectează epigenetica diferitelor gene implicate în moștenirea următoarei generații de dezechilibre metabolice asociate cu sensibilitatea la insulină 6, 7 .

Adiponectina, care este exprimată selectiv în adipocite, modulează homeostazia energiei întregului corp prin reglarea metabolismului glucozei și lipidelor 8, 9. În țesuturile metabolice, adiponectina crește sensibilitatea la insulină, promovând utilizarea glucozei și oxidarea acizilor grași 9, 10. În plus, adiponectina suprimă răspunsul imun indus de obezitate și dezvoltarea factorilor de risc aterogenici 11, 12. Astfel, suplimentarea adiponectinei sau a unui agonist al receptorului adiponectinei îmbunătățește sensibilitatea la insulină și parametrii metabolici la modelele animale obeze 13, 14. Interesant, expresia adiponectinei și nivelurile serice sunt corelate negativ cu bolile metabolice asociate cu obezitatea și obezitatea, cum ar fi rezistența la insulină, diabetul de tip 2 și bolile cardiovasculare15.

În general, expresia adiponectinei este controlată în mai multe etape de reglare, cum ar fi reglarea transcripțională și posttranslațională, incluzând aranjamentul și secreția oligomerică. În obezitate, un astfel de mecanism de reglare al adiponectinei este perturbat de mai mulți factori, inclusiv hipertrofia adipocitelor, inflamația și stresul oxidativ, ducând la hipoadiponectinemie 15, 16, 17. Dintre aceștia, dovezile crescânde sugerează că hipoadiponectinemia în obezitate este atribuită în primul rând eșecului transcripției 19. Foarte important, mecanismul molecular subiacent care mediază o astfel de dereglare a obezității nu a fost elucidat. În special, nu s-a investigat dacă modificările epigenetice, cum ar fi metilarea ADN-ului, joacă un rol în dereglarea expresiei genei adiponectinei în obezitate.

În acest studiu, am investigat rolul metilării ADN-ului în expresia genei adiponectinei. Am constatat că hipermetilarea promotorului adiponectinei inhibă transcripția adiponectinei. În plus, metilarea ADN-ului în promotorul adiponectinei este mediată de ADN metiltransferaza (DNMT) 1, a cărei expresie este crescută în adipocite la subiecții obezi. În plus, stimularea expresiei adiponectinei prin suprimarea activității DNMT1 a suprimat răspunsurile inflamatorii și a crescut sensibilitatea la insulină la șoarecii obezi, ceea ce ar oferi noi perspective asupra mecanismelor care susțin reprogramarea expresiei genei adiponectinei prin metilarea ADN-ului în complicațiile metabolice.

Rezultatul

Promotorul adiponectinei este hipermetilat la subiecții obezi

În concordanță cu rapoartele anterioare 15, 18, 19, nivelurile de mARN de adiponectină au fost semnificativ reduse în adipocite de la șoareci obezi hrăniți cu HFD, în timp ce nivelurile de mARN de factori cheie de transcripție care reglementează adiponectina, inclusiv Ppary2 sau CCAAT/proteina de legare a amplificatorului a (C/ebp) ) nu au fost modificate semnificativ (Figura 1a suplimentară). Această observație ne-a determinat să speculăm cu privire la posibilitatea unor căi alternative implicate în reprimarea transcripțională a adiponectinei în obezitate. Printre diferitele procese biologice, metilarea ADN-ului este unul dintre mecanismele de reglare cheie ale transcripției care controlează accesul mecanismului transcripțional la situsurile țintă prin modularea structurii cromatinei 20. În plus, descoperirile recente au arătat că metilarea ADN-ului este un mecanism activ de reglare care răspunde la modificările etichetelor nutriționale cu efecte multiple asupra reglării homeostaziei energetice sistemice 2, 3, 4, 5, 6, 7 .

indusă

Adipocitele 3T3-L1 diferențiate au fost incubate cu TNFa (10 ng ml-1) sau IL-1β (10 ng ml-1) timp de 24 de ore sau fără. ( A, b ) nivelurile de ARNm de adiponectină, Dnmt1 și Mcp-1. ( c ) activitatea enzimatică relativă a DNMT. ( d, e ) Analiza secvenței R2 bisulfit și cuantificarea 5-mC. ( f ) Test de accesibilitate a enzimei de restricție. Nivelurile de ARNm au fost măsurate prin qPCR. ( g ) Analiza R2 ChIP. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± 3 eșantioane independente (n = 3). Rezultate similare au fost obținute prin cel puțin mai mult de trei experimente independente. * P

Șoarecii db/db sau adiponectina și receptorul leptinei DKO au fost injectați cu vehicul (1% DMSO; Veh, n = 4-5) sau RG108 (n = 4-5). ( A ) Nivelurile serice de adiponectină au fost determinate de ELISA. b ) Nivelurile de glucoză și insulină în repaus alimentar. c ) nivelurile serice de TG. d ) OGTT. După 16 ore de post, șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu 1 g kg-1 greutate corporală de glucoză, iar nivelurile de glucoză din sânge au fost monitorizate. Sunt prezentate cursuri temporale de clearance al sângelui și ASC. ( e ) Nivelurile de ARNm genetice inflamatorii au fost examinate în eWAT. Nivelurile de ARNm au fost măsurate prin qPCR. ( f ) Analiza histologică a ficatului (colorare H&E). Scală, 50 μm. g ) Conținut TG hepatic. Rezultatele sunt exprimate ca medie ± sem * P

În obezitate, DNMT1 crescut induce hipermetilarea ADN-ului într-o anumită regiune (R2) a promotorului adiponectinei, ducând la suprimarea expresiei genei adiponectinei în adipocite.

Imagine la dimensiune completă

Deoarece țesutul adipos se confruntă simultan cu complicații metabolice corelate, inclusiv inflamația cronică, stresul reticulului endoplasmatic, disfuncția mitocondrială și hipoxia la obezitate 31, 32, am investigat care factori joacă un rol critic în suprimarea expresiei genei adiponectinei în adipocitele mediate de DNMT1. semnalizarea inflamatorie, cum ar fi TNFα și IL-1β, a stimulat expresia/activitatea DNMT1 și a îmbunătățit metilarea ADN-ului în R2 în adipocite, care suprimă expresia adiponectinei. Pe de altă parte, tratamentul acut al tunicamicinei, rotenonei sau hipoxiei a suprimat puternic expresia genei adiponectinei, indiferent de expresia DNMT1 și metilarea ulterioară a ADN-ului. Cu toate acestea, aceste condiții fiziopatologice sunt împărtășite de mulți jucători și puncte de auz, ceea ce duce în cele din urmă la dereglarea țesutului adipos31. Astfel, hipermetilarea R2 indusă de obezitate in vivo este mai probabil datorită acumulării de răspunsuri pro-inflamatorii de către mai mulți factori implicați în dereglarea țesutului adipos.

În acest studiu, am identificat mai mulți candidați asociați fie cu proteine ​​legate de R2, fie de R2 ca răspuns la stimularea pro-inflamatorie. A existat o creștere a legării anumitor tipuri de proteine ​​reglatoare transcripționale implicate în modificarea histonelor pe R2. De exemplu, se cunoaște faptul că factorul de îmbinare a factorului bogat în prolină și glutamină (SFPQ) și ubiquitina ligază asemănătoare cu delta 3 (DTX3L), care au fost legate de R2 pe TNFα, sunt implicate în reprimarea transcripțională și remodelarea cromatinei 33, 34. În plus, după cum sugerează alte rapoarte 35, 36, 37, DNMT1 are capacitatea de a metila secvențele selective de ADN prin formarea complexelor cu factori de transcripție specifici. Astfel, este probabil ca DNMT1 să fie condus la R2 prin interacțiunea cu un anumit factor de transcripție a cărui legare la R2 ar fi modificată de obezitate. Prin urmare, este clar important să se elucideze rolurile acestor proteine ​​nou identificate în supresia adiponectinei mediată de obezitate în studiile viitoare.

Studiile anterioare au abordat corelația dintre polimorfismele unice nucleotidice adiponectinei umane (SNP) și nivelurile serice de adiponectină 38, 39, 40, 41, 42. Interesant este că două SNP (rs17300539 și rs266729), care prezintă o corelație semnificativă cu nivelurile serice de adiponectină 43, 44, 45, 46, sunt situate în R2 al promotorului adiponectinei umane și pot servi drept dinucleotide CpG deoarece C este poziția din față a fiecare SNP (Figura 2 suplimentară). De exemplu, subiecții umani cu substituție de la G la A (genotipul rs17300539 A/A) prezintă niveluri mai mari de adiponectină plasmatică în plasmă decât indivizii cu genotipul rs17300539 G/G. În mod similar, subiecții umani cu substituție C la G (rs266729 genotip G/G) arată concentrații plasmatice mai mici de adiponectină în comparație cu indivizii cu genotipul C/C. Prin urmare, descoperirile noastre și datele SNP umane susțin cu tărie rolul critic al hipermetilării ADN în suprimarea expresiei adiponectinei.

În general, acest studiu ilustrează una dintre regiunile de reglare cheie din gena adiponectinei, a cărei modificare ADN și remodelarea cromatinei sunt importante în suprimarea expresiei adiponectinei indusă de obezitate. În special, aceste date demonstrează fezabilitatea stimulării exprimării adiponectinei de către un inhibitor DNMT pentru terapeutice potențiale împotriva bolilor legate de obezitate.

metode

Experimente pe animale

Măsurarea proteinelor și lipidelor serice

Nivelurile serice de insulină au fost măsurate prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA) (Shibayagi Co. Ltd., AKRIN-001T). Activitatea alaninei aminotransferazei și aspartatului aminotransferazei serice a fost măsurată utilizând un kit de testare a activității (Biovision, K752-100, K753-100 și Sigma Aldrich, MAK052-1KT, MAK055-1KT). Kituri de testare au fost utilizate pentru a măsura serul TG (Thermo Fischer Scientific Inc., TR22321 și Sigma Aldrich, T2449-10ML) și FFA (Roche, 11.383.174.001). Nivelurile serice de adiponectină au fost măsurate folosind un kit ELISA acasă (Universitatea din Hong Kong). Analiza și cuantificarea oligomerizării adiponectinei s-au efectuat folosind filtrarea pe gel așa cum s-a descris mai sus 47. Pe scurt, 10 pl de ser au fost diluați cu 1 ml de PBS. Sere diluate au fost aplicate unui sistem de cromatograf flash proteină flash AKTA, fracționat pe o coloană Hiload 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, 28-9893-35) și eluat cu PBS la un debit de 1 ml min-1. Fiecare fracție de 0,5 ml a fost colectată și supusă analizei ELISA.

Probele umane

Probele de țesut adipos uman au fost obținute de la 12 subiecți de la Centrul de Cercetare a Obezității de la Colegiul de Medicină al Universității King Saud, Riyadh, Arabia Saudită. Protocolul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Colegiului Medicinii, Universitatea King Saud și a fost obținut consimțământul informat în scris de la toți participanții pentru a se înscrie la studiu. După fracționarea adipocitelor și extracția ADN genomic, nivelurile de metilare ale promotorului adiponectinei din regiunea R2 au fost analizate prin secvențierea bisulfitului. După extracția ARN, ARN a fost transcris invers în ADN complementar (ADNc) și apoi utilizat în PCR cantitativă în timp real (qPCR).

Fracționarea țesutului adipos și citometria în flux

Purificarea ADN-ului genomic și secvențierea bisulfitului

ADN-ul a fost purificat prin extracție cu fenol și cloroform. Celulele au fost lizate timp de 1 h în tampon de liză (50 mM Tris-Cl (pH 8,0), 50 mM acid etilendiaminetetraacetic (EDTA; pH 8,0), 100 mM NaCl, 2% SDS și 20 μg ml-1 RNază) la 37 ° C și digerat cu 10 μg ml-1 proteinază K timp de 3 ore la 50 ° C. Conversia bisulfitului a fost efectuată utilizând trusa EpiTect Bisulfite (Qiagen, 59104). ADN-ul convertit a fost amplificat prin PCR folosind primerii proiectați cu software-ul Methprimer (www.urogene.org/methprimer/index1.html). Condițiile PCR au fost de 95 ° C timp de 7 minute și 35 de cicluri la 95 ° C timp de 1 min, 55 ° C 30 și 72 ° C timp de 1 min, urmate de 10 minute la 72 ° C. Produsele PCR clonate în bacterii utilizând TOPO TA set de clonare (Invitrogen, 450641). Opt clone pentru fiecare probă au fost secvențiate folosind serviciile comerciale COSMO Genetech. Secvențele de grund care au fost utilizate pentru PCR sunt listate în tabelul suplimentar 2.

Cultura celulară și transfecția tranzitorie

Celulele 3T3-L1 au fost obținute de la ATCC (CL-173). Celulele 3T3-L1 au fost crescute până la confluența în mediul Eagle modificat al lui Dulbecco (DMEM; Hyclone, SH30243.01) suplimentat cu 10% ser de vițel bovin (Gibco, 26010-074). Pentru a induce diferențierea adipocitelor, celulele 3T3-L1 au fost incubate cu DMEM conținând 10% ser fetal bovin (FBS; Hyclone, SH30919.03), 0,55 mM 3-izobutil-1-metilxantină (Sigma Aldrich, I5879) la 2 zile după confluență. dexametazonă (Sigma Aldrich, D1756) și 1 μg ml-1 insulină (Roche, 11.376.497.001) timp de 2 zile. Apoi, mediul de cultură a fost înlocuit cu DMEM conținând 10% FBS și 1 μg ml-1 insulină, iar celulele au fost cultivate timp de încă 2 zile. Mediul de cultură a fost schimbat la fiecare 2 zile cu DMEM conținând 10% FBS.

Duplexurile mici de ARN interferente au fost proiectate și achiziționate de la Bioneer (DNMT1, 1350629; DNMT3a, 1350650). Vectorul pcDNA3-DNMT1 a fost donat cu amabilitate de Dr. Francois Fuks (Universitatea Liberă din Bruxelles, Belgia). Fiecare ARN interferent mic (20 μM), pcDNA3.1-myc-His și pcDNA3.1-DNMT1 au fost livrate către celulele 3T3-L1 folosind un microporator (Digital Bio Technology Co. Ltd.).

În diferite experimente patologice care imită mediul, adipocite 3T3-L1 diferențiate au fost incubate cu sau fără 10 ng ml-1 TNFα (R&D Systems, 210-TA), 10 ng ml-1 IL-1β (R&D Systems, 201-LB) 1 ug ml-1 tunicamicină (Calbiochem, 654080), rotenonă 1 μM (Sigma Aldrich, R8875) sau incubată în condiții normale sau hipoxice (concentrație de O 2%) timp de 24 de ore. Pentru a inhiba activitatea DNMT1, adipocitele 3T3-L1 au fost preincubate cu RG108 (100 μM) cu 24 de ore înainte de tratamentul cu TNFα.

Izolarea ARN și qPCR

Izolarea ARN și procedura de sinteză a ADNc au fost efectuate așa cum s-a descris anterior. Pe scurt, ARN-ul total a fost izolat din celule de șoareci sau linii celulare cu reactiv TRIzol (Ambion, 15596-018) și supus sintezei ADNc utilizând trusa de sinteză Maxima First Strand cPNA pentru qPCR (Thermo Scientific, K1642). ARN din adipocite umane purificate a fost extras folosind kitul de țesut lipidic RNeasy (Qiagen, 74804) și a fost supus sintezei ADNc utilizând un kit ARN-la-ADNc de mare capacitate (Applied Biosystems, 4387406). Nivelurile relative de ARNm au fost măsurate utilizând un sistem CFX96 în timp real (Bio-Rad Laboratories Inc.) și calculate prin normalizarea la nivelurile de ARNm ciclofilină (celule de șoarece sau linii celulare) sau niveluri de ARNm GAPDH (celule umane). Secvențele primare utilizate pentru analizele PCR cantitative în timp real sunt enumerate în Tabelul 3 suplimentar.

Test de accesibilitate a enzimei de restricție

Testul de accesibilitate a enzimei de restricție a fost descris anterior 50. Pe scurt, adipocitele țesutului adipos epididimal și celulele 3T3-L1 au fost recoltate cu tampon RSB (10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 10 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), 5 mM butirat, 10 mM NaF și 1 mM NaVO 7, suplimentat cu inhibitori de protează) și incubat timp de 20 de minute pe gheață. Peletele de celule au fost omogenizate folosind seringi de 27 g, centrifugate la 2.000 rpm la 4 ° C timp de 5 minute și resuspendate în 100 pl de tampon RSB proaspăt. ADNc resuspendat a fost digerat cu 100 U de AluI, EcoRI și BamHI (TaKaRa, 1004A, 1040A și 1010A). Reacțiile au fost oprite prin adăugarea de proteinază K și 2% SDS timp de 6 ore la 45 ° C. ADN-ul cromozomial a fost apoi extras de două ori cu fenol-cloroform, precipitat cu izopropanol și resuspendat în apă distilată. ADN-ul precipitat a fost amplificat prin PCR. Cantitățile relative de produs PCR au fost măsurate utilizând sistemul CFX96 în timp real (Bio-Rad Laboratories Inc.) Secvențele de grund care au fost utilizate pentru PCR sunt furnizate în Tabelul 2 suplimentar.

Imunoprecipitarea cromatinei

Western blot

Testul activității enzimatice DNMT

Pentru purificarea extractelor nucleare, celulele au fost colectate în tampon hipotonic (50 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,8), cocktail inhibitor de protează (GeneDEPOT, P3100)) cu 0,5% NP-40. Celulele colectate au fost incubate pe gheață timp de 10 min și spălate cu tampon hipotonic fără NP-40 de două ori. După îndepărtarea supernatantului, peletele au fost resuspendate cu tampon de extracție a nucleului (500 mM KCI, 10% glicerol, 25 mM HEPES (pH 7,8), cocktail inhibitor de protează) și incubate timp de 5 min. Supernatantul a fost colectat pentru evaluarea proteinelor nucleare după centrifugare. Testul activității enzimatice DNMT a fost realizat folosind trusa EpiQuik DNA Methyltransferase DNA Activity/Inhibition Assay Kit (Epigentek Group Inc., P-3001) cu extract nuclear.

Purificarea și caracterizarea proteinei care leagă R2

analize statistice

Toate rezultatele sunt prezentate ca media ± sem. Semnificația statistică a fost evaluată prin testul t al Studentului cu două cozi utilizând GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software). Nu a existat nicio diferență în varianțele pentru toate comparațiile în testul F. Când celulele au fost utilizate pentru experimente, au fost alese trei replici pe grup. Toate n valorile definite în legende se referă la replici biologice, cu excepția cazului în care se indică altfel. În experimentele de șoarece care necesită manipulare tehnică, au fost utilizați cel puțin cinci șoareci per grup. Dacă au apărut defecțiuni tehnice, cum ar fi eșecul gavajului oral și injecția intraperitoneală, probele respective au fost excluse din analiza finală. Diferențele au fost considerate semnificative statistic pentru P