denisov

  • obiecte
  • abstract
  • introducere
  • Rezultatul
  • Screening-ul ZooMS pentru reziduurile de hominin
  • Scanare micro CT DC1227
  • Analiza radiocarbonului DC1227
  • Secvențe de ADN mitocondrial (ADNmt) din proba DC1227
  • concluzii
  • metode
  • a mari
  • Scanare CT
  • Analiza ADN-ului mitocondrial
  • Extracția ADN și pregătirea bibliotecii
  • Captarea și secvențierea mitocondrială
  • Procesarea și maparea secvenței
  • Analiza filogenetică
  • Mai multe detalii
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere PDF
  • Informatii suplimentare
  • Fișiere Excel
  • Informații suplimentare 1
  • Comentarii

obiecte

  • arheologie
  • Spectrometrie de masa

abstract

Secvențierea ADN-ului a revoluționat înțelegerea noastră asupra oamenilor arhaici în paleoliticul mediu și superior. Din păcate, deși multe situri paleolitice conțin un număr mare de oase, majoritatea nu au elementele de diagnostic necesare pentru identificarea morfologică tradițională. Drept urmare, regenerarea rămășițelor pleistocene umane este foarte rară. Pentru a rezolva această problemă, am folosit o metodă de îndepărtare a colagenului pe mai mult de 2.000 de oase fragmentate din situl peșterii Denis din Rusia pentru a facilita descoperirea de rămășițe umane. Rezultatul analizei noastre a fost identificarea unui singur os homininic (Denisova 11), susținut de o analiză aprofundată a peptidelor și care s-a dovedit a conține ADN mitocondrial de tip neandertal. Datarea ulterioară cu carbon a arătat că osul avea mai mult de 50.000 de ani. Aici, demonstrăm o amprentă potențială uriașă de colagen pentru a identifica reziduurile de hominină în ansamblurile arheologice foarte fragmentate, îmbunătățind astfel resursele disponibile pentru studii mai largi de dezvoltare umană.

Prin urmare, fosilele de Hominin din Peștera Denis s-au dovedit a fi foarte valoroase în înțelegerea populațiilor arhaice de hominin. Acest lucru este evidențiat de starea excepțională de conservare a moleculelor de ADN străvechi în unele dintre oasele dobândite pe site. De exemplu, falanga Denisovan (Denisova 3) conținea ADN endogen> 70%, care asigura un genom cu acoperire ridicată (30x) 7. Cu toate acestea, în ciuda săpăturilor intensive din Peștera Denis, doar câteva reziduuri de hominin au fost găsite printre miile de oase excavate. Se identifică fie dinți, fie dimensiuni mici, de obicei falange, care sunt mai puțin susceptibile de a dezvolta fragmentare, ducând la pierderea caracteristicilor de diagnostic. O astfel de fragmentare, care este cauzată de taponomie de mediu și activitate carnivoră sau umană, duce la un procent ridicat de recuperare osoasă din acest și multe alte situri arheologice care nu pot fi identificate prin morfologia lor 3, 8. Numai în Galeria de Est a Peșterii Denis, săpăturile între 2005 și 2013 au produs aproximativ 135.600 de oase; Cu toate acestea, 128.591 nu au putut fi identificate 8 .

Aici, aplicăm o metodă de identificare a speciilor prin scanarea în masă a unei peptide de colagen cunoscută sub numele de Zooarchaeology by Mass Spectrometry (ZooMS) la 2.315 fragmente osoase neidentificate arhivate din peștera Denis. Aceste oase non-diagnostice au fost selectate din materialul extras din Galeria de Est a peșterii în 2014. Reziduurile au variat ca dimensiune, variind de obicei de la 3 la 5 cm, cu oase suficient de mari pentru a fi utile pentru analize ulterioare (de exemplu, Carbon și analiza ADN) selectate de preferință. În trecutul recent, analiza ZooMS a reușit să distingă între diferite grupuri de mamifere, inclusiv taxoni domestici 9, 10, taxoni sălbatici terestri 11, 12 și faună marină 13, precum și unii taxoni non-mamiferi 13, 14. Pentru a realiza acest lucru, ZooMS îl folosește pentru a analiza proteina dominantă din os, o amprentă peptidică, colagen de tip 1 (COL1), care este cunoscută pentru longevitatea sa, în special în climele mai reci. Această metodă a dat amprente de colagen în eșantioane de până la

Rezultatul

Screening-ul ZooMS pentru reziduurile de hominin

Markerii umani publicați până acum sunt desemnați A-G. Toate vârfurile numerotate reprezintă peptide confirmate de potrivire a secvenței observate în colagenul uman (cu excepția E, care este cunoscut doar pentru similitudinea cu markerii omologi la alte specii 9).

Imagine la dimensiune completă

Eșantionul, care a fost identificat ca hominin DC1227, a fost excavat din pătratul A-2, stratul 12 al Galeriei de Est. Înainte de prelevare, osul cântărea 1,68 g, cu o lungime maximă de 24,7 mm și o lățime de 8,39 mm. S-au colectat aproximativ 36 mg pentru analiza ZooMS (Fig. 2). Osul pare a fi destul de neglijabil, fără caracteristici morfologice sau dovezi ale modificării scopului, așa că a fost ușor trecut cu vederea în analiza osteologică.

Imagine la dimensiune completă

Scanare micro CT DC1227

Tomografia micro-computerizată (micro-CT) a fost efectuată înainte de prelevarea de probe distructive suplimentare pentru analiza carbonului și a ADN-ului mitocondrial. Datorită rarității acestei descoperiri, micro-CT a fost considerat adecvat pentru identificarea zonelor care au fost afectate de degradarea vizibilă și, prin urmare, ar trebui evitat în viitoarele analize. Rezultatele au arătat că proba a fost foarte densă și fără o serie de microfisuri diagenetice care au trecut prin lungimea sa, fără semne de degradare osoasă. Trei dintre aceste fisuri micrometrice se apropie una de alta prin os, dar nu formează fisuri și nu par să perturbe structura osoasă. Scanarea a evidențiat, de asemenea, gradul de gravare și scobire pe suprafața osoasă, care se poate datora trecerii prin sistemul digestiv al carnivorelor (Figura 3). Un număr de carnivore sunt desemnate la fața locului; datorită apariției hienelor în peștera Denisova, pare probabil că osul a fost gravat de acid prin acizii stomacali ai hienei 8, 20 .

Imagine la dimensiune completă

Analiza radiocarbonului DC1227

Datarea radiocarbonată a fost efectuată la Oxford Radiocarbon Acceleration Unit (ORAU) conform procedurilor și protocoalelor standard 23, cu o vârstă estimată> 49.900 ani BP (OxA-32241), indicând faptul că osul este mai vechi decât limita maximă măsurabilă pentru datarea radiocarbonată. . colagen osos. Rezultatul este complet în conformitate cu epoca geoarologică presupusă în ceea ce privește secvența stratigrafică în loc.

Măsurătorile izotopice ale carbonului și azotului au dat o valoare de 813C -17,3 ‰ și o valoare A515N de 16,4 ‰. Homininele din această regiune returnează de obicei valori ale izotopilor azotului între 13 - 15 ‰, indicate de exemplu între neandertali în Peștera Okladnikov 24. Nivelurile crescute de DC1227 ar putea indica diverse anomalii dietetice, inclusiv o dietă bogată în proteine ​​derivată din organisme cu niveluri trofice mai ridicate, precum peștii de apă dulce 25, 26. Pentru a pune valorile crescute ale izotopilor în contextul potrivit, sunt necesare cercetări suplimentare, care vor fi discutate în viitor. Astfel de studii privind compoziția izotopică a homininei și faunei înrudite din Denisova au potențialul de a dezvălui informații importante despre dieta homininelor paleolitice care trăiesc în Altai, iar astfel de cercetări sunt în curs de desfășurare la Universitatea Oxford.

Secvențe de ADN mitocondrial (ADNmt) din proba DC1227

Am extras ADN din 30,9 mg pulbere osoasă din DC1227 27. O parte alicotă a extractului a fost transferată într-o bibliotecă de ADN monocatenar 28, care a fost îmbogățită pentru fragmente de ADN mitocondrial de hominină folosind sonde mitocondriale 29. Fragmentele de ADN izolate au fost secvențiate și mapate la secvența de referință mitocondrială umană Cambridge (rCRS) revizuită. În total, am identificat 282.502 fragmente unice de ADNmt mai lungi de 35 de perechi de baze (Tabel suplimentar S1).

Pentru a evalua dacă unele dintre fragmentele de ADNmt au fost de origine antică, am folosit faptul că bazele de citozină (C) de la capetele moleculelor de ADN tind să sufere dezaminare în timp și, prin urmare, sunt considerate ca timine (T) de ADN polimerază. Astfel, fragmentele de ADN străvechi aliniate cu o secvență de referință tind să poarte frecvențe ridicate ale substituțiilor aparente de la C la T la capetele lor 5 'și 3' 31, 32, 33. Dintre fragmentele care încep sau se termină în poziții în care baza rCRS este C, 32, 2% și 31, 3% poartă Ts la capetele lor de 5 'și 3' (Figura suplimentară S13), sugerând că moleculele ADN de hominină antice sunt prezente în DC1227.

Pentru a determina dacă ADNmt DC1227 endogen este cel mai direct cu genomul mitocondrial uman modern, neanderthalian sau denisovan, am limitat analiza la secvențe care au o substituție C la T comparativ cu rCRS la unul dintre capetele lor 34 pentru a reduce impactul datelor putative. contaminarea cu ADN-ul uman actual (informații suplimentare). Folosind 36.665 de astfel de secvențe (Tabelul suplimentar S1), genomul mitocondrial al probei DC1227 a fost reconstruit cu o acoperire medie de 130 de ori, cu 63 de poziții rămase acoperite de două sau mai puține secvențe și patru în care mai puțin de două treimi din secvențe conțineau același lucru. baza. Astfel, 67 de posturi nu au putut fi numite cu certitudine.

Comparând ADNmt DC1227 cu ADNmt neanderthalian complet determinat până în prezent, rezultă cinci diferențe de bază față de ADNmt neanderthal Okladnikov 2 33 găsit la aproximativ 60 km de peștera Denis, 12 la 17 diferențe față de neanderthalii din Europa de Vest și de Sud și 31 de diferențe. din Caucaz 35 și Neanderthal în Peștera Denis 5. Pentru comparație, ADNmt de la DC1227 diferă între 174 și 354 de baze de ADNmt al altor grupe de hominină (tabelul suplimentar S2). Astfel, în analiza filogenetică (Fig. 4), genomul mitocondrial DC1227 se încadrează într-o variație de zece neandertalieni, excluzând 311 de oameni contemporani, zece oameni moderni antici, doi denisani și homininul din Pleistocenul mijlociu din Spania. Concluzionăm că individul DC1227 poartă un genom mitocondrial de tip neandertal și este denumit acum Denisova 11.

ADN mt de cimpanzeu (neprezentat) a fost folosit ca grup outgroup. Suportul pentru fiecare ramură se bazează pe 500 de replici bootstrap. Originea geografică a exemplarelor antice este dată în tabelul S2.

Imagine la dimensiune completă

concluzii

metode

a mari

De la fiecare os din grup s-au luat 20 până la 50 mg de os și s-au demineralizat în acid clorhidric (HCI) 0,6 M timp de 18 ore. Reziduul rezultat a fost îndepărtat la un ultrafiltru de tăiere cu greutate moleculară de 30 kDa (MWCO) și centrifugat la 3700 rpm timp de 1 oră. Filtratul a fost apoi spălat de două ori cu 500 pl de bicarbonat de amoniu 50 mM (AmBic) și centrifugat în continuare la 3700 rpm. Timp de o jumătate de oră după fiecare tratament. Reziduul final a fost resuspendat cu AmBic suplimentar (200 μL), jumătate din care a fost îndepărtat pentru a forma o probă de rezervă înainte de digestie. Restul de 100 μl a fost apoi tratat cu 0,2 μg tripsină (etapă de secvențiere; Promega UK) și incubat la 37 ° C timp de 18 ore. Soluția rezultată a fost apoi amestecată cu o soluție matricială de 1 μl de soluție de acid α-ciano-4-hidroxicinamic (10 mg/ml în 50% acetonitril (ACN)/0,1% acid trifluoroacetic (TFA)) și lăsată să se cristalizeze. și analizat folosind un spectrometru de masă Bruker Ultraflex II (Bruker Daltonics, Bremen) MALDI Tof/Tof. Spectrele de masă rezultate au fost selectate pentru markerii umani 9, 12 în software-ul FlexAnalysis.

Scanare CT

Scanarea CT a fost efectuată utilizând un micro scaner Nikon XT H 225 cu o țintă de transfer. S-au încercat menținerea dozei cât mai scăzută posibil, pentru a evita orice deteriorare a probei, astfel încât scanarea a fost efectuată la 70kv și 80 μA. Un total de 1448 de proiecte au fost implementate în două imagini pe proiecție, cu expunerea setată la 100 ms și mărirea la × 7, 2. Datele au fost reconstruite folosind software-ul CT Pro 3D și prelucrate folosind software-ul VG Studio Max 2.1.

Analiza ADN-ului mitocondrial

Extracția ADN și pregătirea bibliotecii

30,9 mg de pulbere osoasă au fost îndepărtate din DC1227 folosind un burghiu dentar. ADN-ul a fost extras folosind un protocol pe bază de silice pentru a obține molecule de ADN scurte 27, 36. 10 pl de extract de ADN (E3128) au fost transformate într-o bibliotecă de ADN monocatenar (A9301) așa cum este descris în 28, 36. Numărul de molecule de ADN din bibliotecă a fost evaluat prin picurare digitală PCR (BioRad QX 200), folosind 1 μl ca intrare pentru analiza EvaGreen (BioRad) cu primerii IS7 și IS837. Biblioteca a fost codificată în linie cu doi indici unici 36, 38 și amplificată cu ADN polimerază AccuPrime Pfx (Life Technologies) 39. Produsele de amplificare au fost purificate folosind kitul de purificare MinElute PCR (Qiagen); și cuantificat pe un fotospectometru NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies).

Captarea și secvențierea mitocondrială

Biblioteca amplificată (A9317) a fost îmbogățită cu un protocol de hibridizare 29 pentru captarea mărgelei folosind sonde 52-dimensionale 40 proiectate în dale cu pereche de bază unică pe rCRS (referință NC_012920 a Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie [NCBI]) în două runde de captare, folosind 1 μg respectiv 0,5 μg de ADN de intrare. Biblioteca capturată (L5502) a fost secvențiată pe o platformă MiSeq (Illumina) folosind capete împerecheate (2 x 76 cicluri) cu o configurație cu index dublu de 38. Un test de extracție a ADN-ului gol și un test de pregătire a bibliotecii goale au fost efectuate pe tot parcursul procedurii ca martori negativi.

Procesarea și maparea secvenței

Apelul de bază a fost făcut folosind Bustard (Illumina). Secvențele adaptorului au fost trunchiate și citirile înainte și înapoi au fost îmbinate în secvențe individuale 41. Secvențele care nu aveau potriviri perfecte cu codurile de bare așteptate au fost eliminate. Cartarea la genomul de referință a fost efectuată utilizând BWA 42 cu parametrii "-n 0, 01-02-1 16500" 7. Duplicatele PCR au fost eliminate prin fuzionarea secvențelor cu coordonate identice de aliniere de început și de sfârșit folosind bam-rmdup (//github.com/udo-stenzel/biohazard). Secvențe mai lungi de 35 de baze cu o calitate a cartografierii mai mare de 30 au fost lăsate pentru analiză ulterioară.

Analiza filogenetică

Secvențele care au o substituție terminală de la C la T au fost utilizate pentru reconstituirea ADNt mt DC1227. Terminalul Ts din prima sau ultima poziție a fiecărei secvențe a fost convertit în Ns pentru a reduce efectul erorilor de secvență derivate din deteriorarea apelului consens. Baza consens a fost determinată dacă poziția a fost acoperită de cel puțin trei secvențe și dacă cel puțin 67% din secvențe, adică mai mult de două treimi din secvențele suprapuse, conțin o bază identică 34 .

ADNmt a fost comparat cu ADNmt 311 oameni actuali 43, 10 vechi oameni moderni 31, 44, 45, 46, 47 zece neandertali 5, 33, 35, 48, 49, doi denisovani 3, 4 și pleistocen mediu hominin 34 și cimpanzeu (Pan troglodytes, NC_001643) 50 din MAFFT 51. Numărul diferențelor de bază dintre secvențe și arborele care leagă vecinul de cele 500 de replici bootstrap 52 pe baza acestor diferențe a fost generat de MEGA6 53 .

Mai multe detalii

Cum se citează acest articol: Brown, S. și colab. Identificarea unui nou os de hominin din Peștera Denis din Siberia prin analize de amprentă a colagenului și ADN-ului mitocondrial. Știință. reprezentant. 6, 23559; doi: 10, 1038/srep23559 (2016).

Cod de acces: Secvența genomică mitocondrială a probei DC1227 (Denisova 11) a fost stocată în GenBank (numărul de acces KU131206).

Informatii suplimentare

Fișiere PDF

Informatii suplimentare

Fișiere Excel

Informații suplimentare 1

Comentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și condițiile și Regulile comunității. Dacă găsiți ceva jignitor sau nu respectați termenii sau liniile directoare, marcați-l ca fiind nepotrivit.