obiecte

abstract

Principalul

Odată cu creșterea rapidă a utilizării și progresul continuu în imagistica abdominală transversală, detectarea chisturilor pancreatice devine tot mai frecventă. Chisturile pancreatice sunt raportate a fi identificate în 1,2% până la 2,6% din tomografia computerizată abdominală. Prevalența crește odată cu vârsta și până la 24% dintre pacienții la autopsie au chisturi pancreatice. 3 Pseudochisturile s-au considerat, în mod istoric, că reprezintă majoritatea chisturilor pancreatice, dar majoritatea acestor leziuni sunt neoplasme chistice. Multe dintre aceste neoplasme, inclusiv cistadenomele seroase, sunt benigne și pot fi monitorizate clinic. În schimb, neoplasmele mucinoase papilare intraductale (IPMN) și neoplaziile chistice mucinoase (MCN) au potențialul de a evolua către adenocarcinom pancreatic invaziv. 4, 5, 6, 7 Ulterior, au fost elaborate și recent actualizate orientări de consens internațional pentru gestionarea IPMN și MCN. 8, 9 Prin urmare, diagnosticul precis este crucial pentru îngrijirea adecvată a pacientului.

În urma studiului PANDA, am integrat analiza mutațională KRAS ca parte a unei evaluări de rutină a neoplasmelor chistice pancreatice. În această lucrare, raportăm experiența noastră clinică și patologică cu testarea KRAS pentru: (1) identificarea prevalenței mutațiilor chistice într-un volum ridicat al serviciului de chist pancreatic; (2) evaluează rolul testării KRAS în diferențierea chisturilor mucinoase de chisturile non-mucinoase; și (3) corelează analiza KRAS cu alte metode de diagnostic acceptate în diagnosticul neoplasmelor pancreatice chistice.

Materiale și metode

cazuri

Aprobarea studiului a fost obținută de la Institutional Review Board al Universității din Pittsburgh. Datele au fost colectate în toate cazurile în care lichidul chistic pancreatic a fost administrat la Centrul Medical al Universității din Pittsburgh, o divizie a patologiei anatomice moleculare pentru analiza KRAS. Aspirarea cu ultrasunete endoscopică obținută dintr-un ac fin a fost obținută de la pacienții care au fost observați la Centrul Medical din Pittsburgh din noiembrie 2006 până în octombrie 2012. În toate cazurile, probele au fost prezentate cu un endoscop din cauza incertitudinii dacă chistul pancreatic a fost o neoplasmă chistică. De exemplu, pacienții cu pseudochisturi care au avut un istoric documentat de traume abdominale au fost deseori excluși din administrarea de lichide. Pacienții cu o suspiciune clinică ridicată de IPMN cu canal major prin endoscopie și imagistică s-au abținut de la analize, deoarece testarea suplimentară nu va afecta gestionarea pacientului. Înregistrările medicale au fost revizuite pentru a documenta datele demografice ale pacienților, descoperirile cu ultrasunete endoscopice, vâscozitatea fluidelor (înregistrate de endoscop), analiza CEA și diagnosticele citopatologice.

În momentul aspirației endoscopice cu ac fin, dacă lichidul chistic pancreatic era de aproximativ 750 μl sau mai mult, cel puțin 500 μl au fost descompuse mai întâi pentru analiza CEA, 200 μl pentru analiza moleculară, iar restul pentru citologie, care include clătirea acului . În unele cazuri, amilaza a fost, de asemenea, evaluată. În cazurile în care au existat 200 până la 750 μl de lichid chistic, sa acordat prioritate citologiei, care include clătirea acului și 200 μl pentru analiza moleculară; pentru CEA, nu a fost prezentat niciun fluid din cauza lichidului insuficient pentru analiză. 9 Având în vedere perioada de timp a studiului, orientările recent publicate ale consensului internațional din 2012 nu au fost aplicate strict la evaluarea criteriilor pentru operațiune. După rezecție, lamele colorate cu hematoxilină și eozină au fost examinate pentru a confirma diagnosticul histologic sau pentru a evalua gradul de displazie și pentru a clasifica subtipul histologic al IPMN rezecate. 13

Analiza CEA

Nivelurile de CEA ale chistului pancreatic au fost evaluate printr-un test „sandwich” imunoenzimatic cu două situri utilizând doi anticorpi monoclonali anti-CEA care reacționează cu epitopi CEA diferiți. Această analiză a fost efectuată pe un Beckman Coulter Unicel DXI 800. Înainte de analiză, probele au fost centrifugate timp de 2 ore și cel puțin 500 μL (optim 1 mL) de probă fără celule au fost adăugate în vasul de reacție. În toate cazurile, testarea a fost efectuată în decurs de 24 de ore de la aspirarea cu ac fin a chistului pancreatic. Cantitatea de CEA prezentă în probă a fost determinată utilizând o curbă de calibrare stocată, în mai multe puncte.

Analiza mutației KRAS

ADN-ul total al genomului a fost izolat din 200 μl de lichid chistic prin separarea coloanei conform instrucțiunilor producătorului (Qiagen, Valencia, CA, SUA). Cantitatea de ADN izolată a fost determinată utilizând un spectrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, SUA). Pentru a detecta mutații, 10-50 ng de ADN au fost amplificate cu primerii care flancează exonul 2 al genei KRAS (primerul direct 5'-GGTGAGTTTGTATTAAAAGGTACTGG-3 'și primerul invers 5'-TCCTGCACCAGTAATATGCA-3') și exonul 3 'al genei KRAS TGAAGTAAAAGGTGCACTG-3 'și grund invers 5'-GCATGGCATTAGCAAAGACTC-3'). Apoi, produsele PCR au fost secvențiate atât în ​​sens cât și în sens antisens folosind kitul de secvențiere ciclică BigDye Terminator v3.1 pe un ABI 3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Electroferogramele de secvență au fost analizate utilizând software-ul Mutation Surveyor (SoftGenetics, LLC, State College, PA, SUA). Fiecare caz a fost clasificat ca pozitiv sau negativ pentru mutația KRAS pe baza rezultatelor secvențiale.

analize statistice

Analiza statistică pentru a evalua diferențele dintre chisturile mutante KRAS și șobolanii CRAS a fost comparată utilizând testul exact Fisher pentru variabilele dihotomice. Toate testele au fost cu două cozi și semnificația statistică a fost definită ca valoarea P.

integrarea

KRAS- ramură mutantă, neoplasm mucinos papilar intraductal (IPMN). A ) Chisturile anecoice și septice au fost identificate în corpul pancreatic prin ultrasunete endoscopică. Chistul măsura 1,8 cm în diametru transversal maxim și nu comunica cu canalul principal. La aspirarea cu un ac fin, sa constatat că fluidul este ușor vâscos. b ) Frotiurile citologice au fost mai puțin decât optime și au prezentat predominant mucină cu histiocite și limfocite rare. Pacientul a suferit pancreatectomie distală din cauza unei tumori neuroendocrine pancreatice accidentale, dar chistul ( c, d ) a fost în concordanță cu conducta de ramificare, IPMN cu displazie de nivel scăzut și mucoasă gastrică.

Imagine la dimensiune completă

Un total de 25 din 89 (28%) chisturi de tip KRAS au fost adenocarcinoame asociate IPMN sau IPMN. Aceasta a inclus 10 (40%) IPMN-uri ale canalelor ramificate, 7 (28%) IPMN-uri ale canalelor majore, 3 (12%) canale IPMN majore și ramificate mixte și 5 (20%) adenocarcinoame legate de IPMN. Pe baza subtipului histologic, 12 (48%) au fost gastrice, 9 (36%) intestinale și 4 (16%) pancreatobiliare. Similar cu IPMN-urile mutante KRAS, displazia de grad scăzut (11 din 25, 44%) a fost mai răspândită, urmată de moderată (n = 8, 32%) și ridicată (n = 6, 24%). Din nou, în ceea ce privește adecvarea eșantionului ca factor în evaluarea stării mutației KRAS, 12 din 25 (48%) IPMN de tip CRAS comparativ cu 21 din 50 (42%) IPMN KRAS mutante au fost mai puțin decât optime sau nesatisfăcătoare pentru statutul citopatologic. diagnostic.

Dintre IPMN rezecate, nu a existat nicio corelație între starea KRAS și sexul pacientului (P = 0,22), vârsta medie (P = 0,60), dimensiunea medie a chistului (P = 0,52), localizarea chistului (P = 0,46). = 0,63), viscozitatea fluidului (P = 1,00), nivelurile CEA (P = 0,36) sau concentrația medie de ADN (P = 0,96) a fost observată. Cu toate acestea, prevalența mutațiilor KRAS a fost mai mare în IPMN, care a inclus o ramură de ramificare (P = 0,03), un subtip histologic gastric (P = 0,01) și displazie mică de grad scăzut (P = 0,01). În plus, absența mutațiilor KRAS s-a corelat cu IPMN de tip intestinal (P = 0,04).

Neoplasme chistice mucinoase

Toate cele 22 de MCN au fost identificate la femei cu vârste cuprinse între 20 și 75 de ani (medie, 46, 9 ani). Chisturile au măsurat 2,0 până la 9,9 cm (diametru, 4,5 cm) și au fost plasate în pancreasul distal. Cincisprezece (67%) se aflau în coada pancreasului, în timp ce 7 (33%) erau în corp. Aspirația endoscopică cu ultrasunete cu un ac fin a arătat că lichidul chistic era subțire și apos în 10 (45%) cazuri și vâscos în 12 (55%). Analiza CEA a fost efectuată pe 21 din 22 (95%) MCN și a crescut în 12 (55%). La rezecție, majoritatea MCN au avut displazie de grad scăzut (16 din 22,73%), în timp ce restul au avut displazie de grad moderat (n = 6,29%). Un total de 3 din 22 (14%) MCN conțineau mutația KRAS (Figura 2). Cu toate acestea, nu s-au observat diferențe semnificative în ceea ce privește datele demografice ale pacienților, descoperirile cu ultrasunete endoscopice, adecvarea probei, analiza lichidului chistic, concentrația medie a ADN-ului sau caracteristicile histologice, comparativ cu MCN de tip KRAS. .

KRAS- neoplasm chistic mucinos mucant (MCN). ( A Chistul anecoic și cu întărire distală a fost identificat în corpul/coada pancreasului prin ultrasunete endoscopică. Chistul a măsurat 6,5 cm în diametrul transversal maxim. Au fost identificate mai multe compartimente subțiri. Lichidul obținut prin aspirare cu un ac fin s-a dovedit a fi limpede și subțire. ( b ) Frotiurile citologice au fost mai puțin decât optime, dar eșantionul de citospină a arătat un număr modest de histiocite în fondul mucinei, în concordanță cu conținutul de chist. ( c, d ) O probă de pancreatectomie distală a demonstrat un chist multiloculat cu o căptușeală epitelială mucinoasă. Nucleii erau uniformi și orientați bazal. Sub căptușeala chistului, stromaria densă de tip ovarian a fost în concordanță cu MCN.

Imagine la dimensiune completă

Corelarea stării KRAS și a altor constatări ale aspirației fine cu ultrasunete endoscopice cu IPMN și MCN rezecate chirurgical

În general, mutațiile KRAS au avut o specificitate de 100% pentru diferențierea mucinoasă în chisturile pancreatice rezecate chirurgical, dar numai cu o sensibilitate de 54%. În comparație, vâscozitatea fluidă crescută și CEA crescută au avut specificitate mai mică (69% și 85%), dar sensibilitate mai mare (68% și 62%). Diagnosticul citopatologic al cel puțin suspecților pentru chistul mucinos neoplazic a avut o specificitate similară de 73%, dar o sensibilitate semnificativ mai mică de 39%. Pentru IPMN, prezența chisturilor multiple a avut o specificitate de 59% și o sensibilitate de 80%. Combinația de mutații punctuale KRAS și CEA crescută a îmbunătățit sensibilitatea ambelor teste la 83% și a menținut o specificitate ridicată de 85% pentru diferențierea mucinoasă. Adăugarea vâscozității fluidului la KRAS și CEA a crescut sensibilitatea (90%), dar cu pierderea specificității (64%). Abordarea multimodală folosind KRAS, CEA, vâscozitatea fluidelor și citologia a crescut și mai mult sensibilitatea la 91%, dar a scăzut specificitatea la 56%.

Când a fost stratificat după tipul de chist, KRAS a avut specificitate și sensibilitate de 95% și 67% pentru IPMN-uri față de 58% și 14% pentru MCN. Deși IPMN-urile sunt adesea multifocale, tind să aibă CEA crescut și prezintă adesea vâscozitate fluidă crescută, specificitatea fiecărui parametru a fost mai mică (86%, 69% și 66%) comparativ cu KRAS. În plus, sensibilitatea a fost fie similară, fie ușor mai mică (48%, 68% și 63%). Pentru MCN, CEA crescut a avut specificitate mai mare (71% vs. 58%) și sensibilitate (55% vs. 14%) decât KRAS. În schimb, vâscozitatea fluidă crescută a avut o specificitate mai mică de 48%, dar o sensibilitate mai mare de 55%. Toate MCN-urile din acest studiu au fost solitare.

discuţie

Studiul PANDA a fost cel mai mare test multicentric realizat până în prezent pentru a evalua analiza moleculară a lichidului chistic pancreatic în diagnosticul chisturilor mucinoase. A inclus 113 pacienți cu chisturi pancreatice care au suferit rezecție chirurgicală sau au avut aspirație citologică de diagnostic. ADN-ul lichidului chistic a fost obținut prin aspirație endoscopică cu ac fin și analizat într-un laborator comercial, Redpath Integrated Pathology (Pittsburgh, PA, SUA). Analiza moleculară a inclus cuantificarea ADN-ului, testarea codonilor KRAS 12 și analiza pierderii alelice a unui panou larg de markeri microsateliți, inclusiv secvențierea. Mutațiile codonului KRAS 12 au prezentat cel mai mare raport de probabilități (20, 9) și specificitate (96%), dar sensibilitate redusă (45%) la diferențierea mucinoasă. În comparație, CEA crescut a avut specificitate și sensibilitate de 83%, respectiv 64%. Analiza mutației KRAS a crescut sensibilitatea testului CEA de la 64% la 82%, menținând în același timp specificitatea la 83%.

Într-un efort de a aborda problemele care decurg din studiul PANDA, am integrat testarea KRAS ca parte a evaluării de rutină a neoplasmelor chistice pancreatice ca parte a volumului nostru mare de servicii de chist pancreatic. Prevalența mutațiilor chistului KRAS a fost de 38% pe parcursul a 6 ani. În plus față de mutațiile KRAS localizate la codonul 12, am detectat și mutații la codonii 13 și 61. Deși monitorizarea histologică a corelației a fost prezentă doar la 25% dintre pacienți, au fost rezecate un total de 73 IPMN și 21 MCN. În plus, majoritatea acestor chisturi mucinoase (67%) au prezentat displazie de grad scăzut. Similar cu rezultatele studiului PANDA, mutațiile KRAS au avut o specificitate ridicată (100%), dar o sensibilitate redusă (54%) la chisturile mucinoase. Analiza CEA a avut o specificitate de 85% și o sensibilitate de 62%. În combinație, ambele teste au crescut sensibilitatea la 83%, menținând în același timp o specificitate ridicată de 85%. Reproductibilitatea rezultatelor studiului PANDA cu privire la KRAS confirmă utilitatea sa în identificarea chisturilor mucinoase. Împreună cu analiza CEA, testarea KRAS poate îmbunătăți randamentul diagnostic al aspiratului cu ac fin al chistului pancreatic.

Este demn de remarcat faptul că există încă o părtinire în selecția din studiul nostru. Mai precis, testarea KRAS a fost efectuată la discreția endoscopului. Prin urmare, fluidele chistice de la pseudochisturi la pacienții cu antecedente de traume abdominale sau canale IPMN directe directe prin imagistică au fost omise din analiza KRAS. Cu toate acestea, se poate argumenta că testarea ajutoarelor moleculare nu este necesară în aceste setări. În mod remarcabil, studiile anterioare au arătat că clasificarea lichidului chistic pe baza mutațiilor KRAS poate duce la rezultate fals pozitive. Panarelli și colab. 15 au identificat doi pseudochisti cu mutații KRAS folosind același panou comercial de biomarkeri (PathfinderTG) ca studiul PANDA. Prin urmare, este necesar să se interpreteze rezultatele KRAS ca parte a unei abordări multidisciplinare.

Mutațiile somatice în KRAS sunt frecvente atât în ​​IPMN, cât și în MCN, cu o frecvență raportată variind de la 30% în leziunile de grad scăzut la 80% în leziunile de grad înalt. 18, 19, 20, 21, 22 În conformitate cu studiile anterioare, prevalența mutațiilor KRAS în IPMN a fost de 67%. În schimb, doar 14% din MCN conținea mutația KRAS. Aceste descoperiri se pot datora lipsei de sensibilitate în tehnica noastră de detectare a ADN-ului. Cu toate acestea, mutațiile KRAS din cadrul IPMN au fost identificate în mod constant la o rată comparabilă ca studii folosind material de rezecție chirurgicală sau lichid chistic postoperator. Alternativ, cantitatea de ADN din epiteliul lizat și eliberat obținută prin aspirarea cu ac fin poate fi mai mică decât cantitatea găsită în aspirația postoperatorie datorată manipulării chirurgicale. Sau doar 14% din MCN-urile din grupul nostru de studiu au de fapt mutații KRAS. Oricare ar fi cauza, sunt necesari markeri suplimentari pentru a îmbunătăți sensibilitatea analizei ADN-ului lichidului chistic.

Un aspect important care nu este abordat în acest studiu este capacitatea analizei ADN de a distinge leziunile producătoare de mucină cu displazie de grad scăzut (benigne) de cele cu displazie de grad înalt sau cancer invaziv asociat (malignitate). Mutațiile KRAS singure nu se corelează cu un grad mai ridicat în neoplasmele producătoare de mucină. Studiul PANDA a raportat că analiza multiplă a pierderilor alelice> 82% sau o combinație a mutației KRAS și analiza pierderilor alelice ridicate au fost foarte predictive pentru malignitate. Aceste descoperiri au fost confirmate de Shen și colab., 14 ani, care au analizat 35 de probe de lichide de chist pancreatic folosind Redpath's PathfinderTG. Autorii au găsit un acord de 89% între diagnosticele de consens molecular și clinic, inclusiv 83% pentru maligne, 87% pentru mucoase benigne și 93% pentru chisturi benigne fără zahăr. În contrast, studiul realizat de Panarelli și colab. 15 și Toll și colab. 16 au raportat o rată de conformitate de 39% și 56%. Variabilitatea largă în acord între diagnosticele moleculare și clinice poate fi explicată prin lipsa datelor privind urmărirea chirurgicală din ultimele două studii. Cu toate acestea, ca și în cazul analizei KRAS, sunt necesare studii viitoare care implică o perioadă mai lungă de observare și o urmărire chirurgicală corelată.

În rezumat, prezentăm cea mai mare serie de analize KRAS privind aspirația cu ultrasunete endoscopică cu un ac fin obținut de lichidul chistic pancreatic. În combinație cu descoperirile clinice și radiografice, KRAS a fost foarte specific, dar a avut o sensibilitate slabă la diferențierea mucinoasă. Adăugarea analizei CEA a îmbunătățit sensibilitatea analizei KRAS, menținând în același timp o specificitate ridicată. Când a fost stratificat după tipul de chist mucinos, testarea KRAS a avut o sensibilitate ușoară la IPMN, dar nu a fost suficientă pentru a identifica MCN. Viitoare studii moleculare pentru a include gene suplimentare și alți markeri de lichide sunt necesare pentru a îmbunătăți detectarea și clasificarea mucoasei pancreatice utilizând un ac fin cu ultrasunete endoscopică.